Técnica de laboratorio para multiplicar una muestra de ADN para su estudio.
La reacción en cadena de la polimerasa ( PCR ) es un método ampliamente utilizado para hacer millones o miles de millones de copias de una muestra de ADN específica rápidamente, lo que permite a los científicos amplificar una muestra muy pequeña de ADN (o una parte de ella) lo suficiente como para permitir un estudio detallado. La PCR fue inventada en 1983 por el bioquímico estadounidense Kary Mullis de Cetus Corporation . Mullis y el bioquímico Michael Smith , que habían desarrollado otras formas esenciales de manipular el ADN, recibieron conjuntamente el Premio Nobel de Química en 1993. [1]
La PCR es fundamental para muchos de los procedimientos utilizados en las pruebas e investigaciones genéticas , incluido el análisis de muestras antiguas de ADN y la identificación de agentes infecciosos. Mediante la PCR, las copias de cantidades muy pequeñas de secuencias de ADN se amplifican exponencialmente en una serie de ciclos de cambios de temperatura. La PCR es ahora una técnica común y a menudo indispensable que se utiliza en la investigación de laboratorios médicos para una amplia variedad de aplicaciones, incluida la investigación biomédica y la ciencia forense . [2] [3]
La mayoría de los métodos de PCR se basan en ciclos térmicos . El ciclo térmico expone los reactivos a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento para permitir diferentes reacciones dependientes de la temperatura, específicamente, fusión del ADN y replicación del ADN impulsada por enzimas . La PCR emplea dos reactivos principales: cebadores (que son fragmentos cortos de ADN monocatenario conocidos como oligonucleótidos que son una secuencia complementaria a la región de ADN objetivo) y una ADN polimerasa termoestable . En el primer paso de la PCR, las dos hebras de la doble hélice del ADN se separan físicamente a alta temperatura en un proceso llamado desnaturalización del ácido nucleico . En el segundo paso, se reduce la temperatura y los cebadores se unen a las secuencias complementarias de ADN. Luego, las dos cadenas de ADN se convierten en plantillas para que la ADN polimerasa ensamble enzimáticamente una nueva cadena de ADN a partir de nucleótidos libres , los componentes básicos del ADN. A medida que avanza la PCR, el ADN generado se utiliza como plantilla para la replicación, lo que pone en marcha una reacción en cadena en la que la plantilla de ADN original se amplifica exponencialmente .
Casi todas las aplicaciones de PCR emplean una ADN polimerasa termoestable , como la Taq polimerasa , una enzima originalmente aislada de la bacteria termófila Thermus Aquaticus . Si la polimerasa utilizada fuera sensible al calor, se desnaturalizaría bajo las altas temperaturas del paso de desnaturalización. Antes del uso de la Taq polimerasa, la ADN polimerasa tenía que agregarse manualmente en cada ciclo, lo cual era un proceso tedioso y costoso. [4]
La PCR amplifica una región específica de una cadena de ADN (el objetivo del ADN). La mayoría de los métodos de PCR amplifican fragmentos de ADN de entre 0,1 y 10 kilopares de bases (kpb) de longitud, aunque algunas técnicas permiten la amplificación de fragmentos de hasta 40 kpb. [6] La cantidad de producto amplificado está determinada por los sustratos disponibles en la reacción, lo que se vuelve limitante a medida que avanza la reacción. [7]
Una configuración básica de PCR requiere varios componentes y reactivos, [8] que incluyen:
una plantilla de ADN que contiene la región objetivo del ADN para amplificar
una ADN polimerasa ; una enzima que polimeriza nuevas cadenas de ADN; La polimerasa Taq resistente al calor es especialmente común, [9] ya que es más probable que permanezca intacta durante el proceso de desnaturalización del ADN a alta temperatura.
dos cebadores de ADN que son complementarios a los extremos 3' (tres primos) de cada una de las hebras sentido y antisentido del objetivo de ADN (la ADN polimerasa solo puede unirse y alargarse desde una región bicatenaria de ADN; sin cebadores, no existe un sitio de iniciación de doble cadena al que pueda unirse la polimerasa); [10] Los cebadores específicos que son complementarios a la región objetivo del ADN se seleccionan de antemano y, a menudo, se fabrican a medida en un laboratorio o se compran a proveedores bioquímicos comerciales.
Trifosfatos de desoxinucleósidos , o dNTP (a veces llamados "trifosfatos de desoxinucleótidos"; nucleótidos que contienen grupos trifosfato), los componentes básicos a partir de los cuales la ADN polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN.
una solución tampón que proporciona un entorno químico adecuado para una actividad y estabilidad óptimas de la ADN polimerasa
La reacción se lleva a cabo comúnmente en un volumen de 10 a 200 μL en pequeños tubos de reacción (volúmenes de 0,2 a 0,5 ml) en un ciclador térmico . El termociclador calienta y enfría los tubos de reacción para alcanzar las temperaturas requeridas en cada paso de la reacción (ver más abajo). Muchos termocicladores modernos utilizan un dispositivo Peltier , que permite calentar y enfriar el bloque que contiene los tubos de PCR simplemente invirtiendo la corriente eléctrica del dispositivo. Los tubos de reacción de paredes delgadas permiten una conductividad térmica favorable para permitir un rápido equilibrio térmico. La mayoría de los termocicladores tienen tapas calentadas para evitar la condensación en la parte superior del tubo de reacción. Los termocicladores más antiguos que carecen de tapa calentada requieren una capa de aceite encima de la mezcla de reacción o una bola de cera dentro del tubo.
Procedimiento
Normalmente, la PCR consta de una serie de 20 a 40 cambios de temperatura repetidos, llamados ciclos térmicos, y cada ciclo suele constar de dos o tres pasos de temperatura discretos (consulte la figura siguiente). El ciclo suele ir precedido de un único paso de temperatura a una temperatura muy alta (>90 °C (194 °F)) y seguido de una retención al final para la extensión del producto final o un almacenamiento breve. Las temperaturas utilizadas y el tiempo que se aplican en cada ciclo dependen de una variedad de parámetros, incluida la enzima utilizada para la síntesis de ADN, la concentración de iones bivalentes y dNTP en la reacción y la temperatura de fusión ( Tm ) del cebadores. [12] Los pasos individuales comunes a la mayoría de los métodos de PCR son los siguientes:
Inicialización : este paso solo es necesario para las ADN polimerasas que requieren activación térmica mediante PCR de inicio en caliente . [13] Consiste en calentar la cámara de reacción a una temperatura de 94–96 °C (201–205 °F), o 98 °C (208 °F) si se utilizan polimerasas extremadamente termoestables, que luego se mantiene durante 1– 10 minutos.
Desnaturalización : este paso es el primer evento cíclico regular y consiste en calentar la cámara de reacción a 94–98 °C (201–208 °F) durante 20 a 30 segundos. Esto provoca la fusión o desnaturalización del ADN de la plantilla de ADN bicatenario al romper los enlaces de hidrógeno entre bases complementarias, produciendo dos moléculas de ADN monocatenario.
Recocido : en el siguiente paso, la temperatura de reacción se reduce a 50–65 °C (122–149 °F) durante 20 a 40 segundos, lo que permite el recocido de los cebadores con cada una de las plantillas de ADN monocatenario. Normalmente se incluyen dos cebadores diferentes en la mezcla de reacción: uno para cada uno de los dos complementos monocatenarios que contienen la región diana. Los cebadores son secuencias monocatenarias en sí mismas, pero son mucho más cortas que la longitud de la región diana y complementan sólo secuencias muy cortas en el extremo 3' de cada cadena.
Es fundamental determinar una temperatura adecuada para el paso de recocido porque la eficiencia y la especificidad se ven fuertemente afectadas por la temperatura de recocido. Esta temperatura debe ser lo suficientemente baja para permitir la hibridación del cebador con la hebra, pero lo suficientemente alta para que la hibridación sea específica, es decir, el cebador debe unirse sólo a una parte perfectamente complementaria de la hebra y a ningún otro lugar. Si la temperatura es demasiado baja, la imprimación puede adherirse de manera imperfecta. Si es demasiado alto, es posible que la imprimación no se adhiera en absoluto. Una temperatura de recocido típica es de aproximadamente 3 a 5 °C por debajo de la Tm de los cebadores utilizados. Los enlaces de hidrógeno estables entre bases complementarias se forman sólo cuando la secuencia del cebador coincide mucho con la secuencia del molde. Durante este paso, la polimerasa se une al híbrido cebador-molde y comienza la formación de ADN.
Extensión/elongación : la temperatura en este paso depende de la ADN polimerasa utilizada; la temperatura de actividad óptima para la ADN polimerasa termoestable de la polimerasa Taq es aproximadamente 75–80 °C (167–176 °F), [14] [15] aunque comúnmente se usa una temperatura de 72 °C (162 °F) con esta enzima. En este paso, la ADN polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN complementaria a la cadena plantilla de ADN agregando dNTP libres de la mezcla de reacción que es complementaria a la plantilla en la dirección 5' a 3' , condensando el grupo 5'-fosfato. de los dNTP con el grupo 3'-hidroxi al final de la cadena de ADN naciente (alargada). El tiempo preciso necesario para el alargamiento depende tanto de la ADN polimerasa utilizada como de la longitud de la región diana del ADN que se va a amplificar. Como regla general, a su temperatura óptima, la mayoría de las ADN polimerasas polimerizan mil bases por minuto. En condiciones óptimas (es decir, si no hay limitaciones debido a sustratos o reactivos limitantes), en cada paso de extensión/alargamiento, el número de secuencias diana de ADN se duplica. Con cada ciclo sucesivo, las cadenas plantilla originales más todas las cadenas recién generadas se convierten en cadenas plantilla para la siguiente ronda de elongación, lo que conduce a una amplificación exponencial (geométrica) de la región objetivo del ADN específica.
Los procesos de desnaturalización, recocido y elongación constituyen un ciclo único. Se requieren múltiples ciclos para amplificar el ADN objetivo a millones de copias. La fórmula utilizada para calcular el número de copias de ADN formadas después de un número determinado de ciclos es 2 n , donde n es el número de ciclos. Por lo tanto, una reacción programada para 30 ciclos da como resultado 2 30 , o 1.073.741.824, copias de la región objetivo del ADN bicatenario original.
Elongación final : este único paso es opcional, pero se realiza a una temperatura de 70 a 74 °C (158 a 165 °F) (el rango de temperatura requerido para la actividad óptima de la mayoría de las polimerasas utilizadas en la PCR) durante 5 a 15 minutos después de la último ciclo de PCR para garantizar que el ADN monocatenario restante esté completamente alargado.
Retención final : el paso final enfría la cámara de reacción a 4–15 °C (39–59 °F) durante un tiempo indefinido y puede usarse para el almacenamiento a corto plazo de los productos de PCR.
Para comprobar si la PCR generó con éxito la región diana de ADN anticipada (también denominada a veces amplicón o amplicón ), se puede emplear electroforesis en gel de agarosa para la separación por tamaños de los productos de la PCR. El tamaño de los productos de PCR se determina comparándolo con una escalera de ADN , un marcador de peso molecular que contiene fragmentos de ADN de tamaños conocidos, que se encuentra en el gel junto con los productos de PCR.
Etapas
Como ocurre con otras reacciones químicas, la velocidad de reacción y la eficiencia de la PCR se ven afectadas por factores limitantes. Por lo tanto, todo el proceso de PCR se puede dividir en tres etapas según el progreso de la reacción:
Amplificación exponencial : en cada ciclo, la cantidad de producto se duplica (asumiendo una eficiencia de reacción del 100%). Después de 30 ciclos, una sola copia de ADN puede incrementarse hasta 1.000.000.000 (mil millones) de copias. Entonces, en cierto sentido, la replicación de una cadena discreta de ADN se manipula en un tubo en condiciones controladas. [16] La reacción es muy sensible: sólo deben estar presentes cantidades mínimas de ADN.
Etapa de nivelación : la reacción se ralentiza a medida que la ADN polimerasa pierde actividad y el consumo de reactivos, como dNTP y cebadores, hace que se vuelvan más limitados.
Meseta : No se acumula más producto debido al agotamiento de los reactivos y la enzima.
Mejoramiento
En la práctica, la PCR puede fallar por diversos motivos, como sensibilidad o contaminación. [17] [18] La contaminación con ADN extraño puede dar lugar a productos espurios y se aborda con protocolos y procedimientos de laboratorio que separan las mezclas previas a la PCR de los posibles contaminantes de ADN. [8] Por ejemplo, si se analiza el ADN de la escena de un crimen, una sola molécula de ADN del personal del laboratorio podría amplificarse y desviar la investigación. Por lo tanto, las áreas de configuración de la PCR están separadas del análisis o purificación de otros productos de PCR, se utiliza material de plástico desechable y la superficie de trabajo entre las configuraciones de reacción debe limpiarse a fondo.
La especificidad se puede ajustar mediante condiciones experimentales para que no se generen productos espurios. Las técnicas de diseño de cebadores son importantes para mejorar el rendimiento del producto de PCR y evitar la formación de productos inespecíficos. El uso de componentes tampón alternativos o enzimas polimerasas puede ayudar con la amplificación de regiones de ADN largas o problemáticas. Por ejemplo, se dice que la polimerasa Q5 es aproximadamente 280 veces menos propensa a errores que la polimerasa Taq. [19] [20] Tanto los parámetros de ejecución (por ejemplo, temperatura y duración de los ciclos) como la adición de reactivos, como formamida , pueden aumentar la especificidad y el rendimiento de la PCR. [21] Se pueden realizar simulaciones por computadora de resultados teóricos de PCR ( PCR electrónica ) para ayudar en el diseño de cebadores. [22]
Aplicaciones
Aislamiento selectivo de ADN.
La PCR permite el aislamiento de fragmentos de ADN a partir de ADN genómico mediante la amplificación selectiva de una región específica de ADN. Este uso de la PCR aumenta muchas formas, como la generación de sondas de hibridación para la hibridación Southern o Northern y la clonación de ADN , que requieren mayores cantidades de ADN, que representan una región de ADN específica. La PCR proporciona a estas técnicas grandes cantidades de ADN puro, lo que permite el análisis de muestras de ADN incluso a partir de cantidades muy pequeñas de material de partida.
Otras aplicaciones de la PCR incluyen la secuenciación de ADN para determinar secuencias desconocidas amplificadas por PCR en las que uno de los cebadores de amplificación puede usarse en la secuenciación de Sanger , el aislamiento de una secuencia de ADN para acelerar las tecnologías de ADN recombinante que implican la inserción de una secuencia de ADN en un plásmido , un fago , o cósmido (según el tamaño) o el material genético de otro organismo. Las colonias bacterianas (como E. coli ) se pueden detectar rápidamente mediante PCR para detectar construcciones de vectores de ADN correctas . [23] La PCR también puede utilizarse para la toma de huellas genéticas ; una técnica forense utilizada para identificar a una persona u organismo comparando ADN experimental a través de diferentes métodos basados en PCR.
Algunos métodos de huellas dactilares por PCR tienen un alto poder discriminativo y pueden usarse para identificar relaciones genéticas entre individuos, como entre padres e hijos o entre hermanos, y se usan en pruebas de paternidad (Fig. 4). Esta técnica también se puede utilizar para determinar las relaciones evolutivas entre organismos cuando se utilizan ciertos relojes moleculares (es decir, los genes 16S rRNA y recA de los microorganismos). [24]
Amplificación y cuantificación de ADN.
Debido a que la PCR amplifica las regiones del ADN a las que se dirige, la PCR se puede utilizar para analizar cantidades extremadamente pequeñas de muestra. Esto suele ser fundamental para el análisis forense , cuando sólo se dispone de una pequeña cantidad de ADN como prueba. La PCR también se puede utilizar en el análisis de ADN antiguo que tiene decenas de miles de años. Estas técnicas basadas en PCR se han utilizado con éxito en animales, como un mamut de cuarenta mil años , y también en ADN humano, en aplicaciones que van desde el análisis de momias egipcias hasta la identificación de un zar ruso y el cuerpo de Rey inglés Ricardo III . [25]
Los métodos de PCR cuantitativa o PCR en tiempo real (qPCR, [26] que no debe confundirse con RT-PCR ) permiten estimar la cantidad de una secuencia determinada presente en una muestra, una técnica que a menudo se aplica para determinar cuantitativamente los niveles de expresión genética . La PCR cuantitativa es una herramienta establecida para la cuantificación de ADN que mide la acumulación de producto de ADN después de cada ronda de amplificación por PCR.
qPCR permite la cuantificación y detección de una secuencia de ADN específica en tiempo real ya que mide la concentración mientras se produce el proceso de síntesis. Existen dos métodos para la detección y cuantificación simultáneas. El primer método consiste en utilizar colorantes fluorescentes que se retienen de forma inespecífica entre las dobles hebras. El segundo método implica sondas que codifican secuencias específicas y están marcadas con fluorescencia. La detección de ADN mediante estos métodos sólo se puede realizar después de que se produce la hibridación de las sondas con su ADN complementario (ADNc). Una combinación de técnicas interesante es la PCR en tiempo real y la transcripción inversa. Esta sofisticada técnica, denominada RT-qPCR, permite cuantificar una pequeña cantidad de ARN. Mediante esta técnica combinada, el ARNm se convierte en ADNc, que se cuantifica aún más mediante qPCR. Esta técnica reduce la posibilidad de error en el punto final de la PCR, [27] aumentando las posibilidades de detección de genes asociados con enfermedades genéticas como el cáncer. [5] Los laboratorios utilizan RT-qPCR con el fin de medir con sensibilidad la regulación genética. Los fundamentos matemáticos para la cuantificación confiable de la PCR [28] y RT-qPCR [29] facilitan la implementación de procedimientos de ajuste precisos de datos experimentales en aplicaciones de investigación, médicas, de diagnóstico y de enfermedades infecciosas. [30] [31] [32] [33]
Aplicaciones médicas y de diagnóstico.
Los futuros padres pueden ser examinados para determinar si son portadores genéticos , o sus hijos pueden ser examinados para determinar si realmente están afectados por una enfermedad . [2] Las muestras de ADN para pruebas prenatales se pueden obtener mediante amniocentesis , muestreo de vellosidades coriónicas o incluso mediante el análisis de células fetales raras que circulan en el torrente sanguíneo de la madre. El análisis por PCR también es esencial para el diagnóstico genético previo a la implantación , donde se analizan células individuales de un embrión en desarrollo para detectar mutaciones.
La PCR también puede utilizarse como parte de una prueba sensible para la tipificación de tejidos , vital para el trasplante de órganos . A partir de 2008, [actualizar]existe incluso una propuesta para sustituir las tradicionales pruebas de tipo sanguíneo basadas en anticuerpos por pruebas basadas en PCR. [34]
Muchas formas de cáncer implican alteraciones de los oncogenes . Al utilizar pruebas basadas en PCR para estudiar estas mutaciones, los regímenes terapéuticos a veces pueden personalizarse individualmente para cada paciente. La PCR permite el diagnóstico precoz de enfermedades malignas como la leucemia y los linfomas , que actualmente es la más desarrollada en la investigación del cáncer y ya se utiliza de forma rutinaria. Los ensayos de PCR se pueden realizar directamente en muestras de ADN genómico para detectar células malignas específicas de translocación con una sensibilidad al menos 10.000 veces mayor que la de otros métodos. [35] La PCR es muy útil en el campo médico ya que permite el aislamiento y amplificación de supresores de tumores. La PCR cuantitativa, por ejemplo, se puede utilizar para cuantificar y analizar células individuales, así como para reconocer confirmaciones y combinaciones de ADN, ARNm y proteínas. [27]
Aplicaciones de enfermedades infecciosas
La PCR permite un diagnóstico rápido y muy específico de enfermedades infecciosas, incluidas las causadas por bacterias o virus. [36] La PCR también permite la identificación de microorganismos no cultivables o de crecimiento lento, como micobacterias , bacterias anaeróbicas o virus a partir de ensayos de cultivos de tejidos y modelos animales . La base de las aplicaciones de diagnóstico por PCR en microbiología es la detección de agentes infecciosos y la discriminación entre cepas no patógenas y patógenas en virtud de genes específicos. [36] [37]
La PCR ha revolucionado la caracterización y detección de organismos patógenos de las siguientes maneras:
El virus de la inmunodeficiencia humana (o VIH ), es un objetivo difícil de encontrar y erradicar. Las primeras pruebas de infección se basaban en la presencia de anticuerpos contra el virus que circulaba en el torrente sanguíneo. Sin embargo, los anticuerpos no aparecen hasta muchas semanas después de la infección, los anticuerpos maternos enmascaran la infección del recién nacido y los agentes terapéuticos para combatir la infección no afectan a los anticuerpos. Se han desarrollado pruebas de PCR que pueden detectar tan solo un genoma viral entre el ADN de más de 50.000 células huésped. [38] Las infecciones se pueden detectar antes, la sangre donada se puede analizar directamente para detectar el virus, se pueden realizar pruebas inmediatas para detectar infecciones en los recién nacidos y se pueden cuantificar los efectos de los tratamientos antivirales .
Algunas enfermedades, como la tuberculosis , son difíciles de tomar de los pacientes y su cultivo en el laboratorio es lento. Las pruebas basadas en PCR han permitido la detección de pequeñas cantidades de organismos patógenos (tanto vivos como muertos), en muestras convenientes . También se puede utilizar un análisis genético detallado para detectar la resistencia a los antibióticos, lo que permite una terapia inmediata y eficaz. Los efectos de la terapia también pueden evaluarse inmediatamente.
La propagación de un organismo patógeno a través de poblaciones de animales domésticos o salvajes puede controlarse mediante pruebas de PCR. En muchos casos, se puede detectar y controlar la aparición de nuevos subtipos virulentos. Los subtipos de un organismo responsable de epidemias anteriores también pueden determinarse mediante análisis de PCR.
El ADN viral se puede detectar mediante PCR. Los cebadores utilizados deben ser específicos de las secuencias objetivo del ADN de un virus, y la PCR se puede utilizar para análisis de diagnóstico o secuenciación del ADN del genoma viral. La alta sensibilidad de la PCR permite la detección del virus poco después de la infección e incluso antes del inicio de la enfermedad. [36] Esta detección temprana puede dar a los médicos un tiempo de espera significativo en el tratamiento. La cantidad de virus (" carga viral ") en un paciente también se puede cuantificar mediante técnicas de cuantificación de ADN basadas en PCR (ver más abajo). Se utiliza una variante de la PCR ( RT-PCR ) para detectar ARN viral en lugar de ADN: en esta prueba se utiliza la enzima transcriptasa inversa para generar una secuencia de ADN que coincide con el ARN viral; A continuación, este ADN se amplifica según el método de PCR habitual. La RT-PCR se utiliza ampliamente para detectar el genoma viral del SARS-CoV-2. [39]
Enfermedades como la tos ferina (o tos ferina ) son causadas por la bacteria Bordetella pertussis . Esta bacteria se caracteriza por una grave infección respiratoria aguda que afecta a varios animales y humanos y ha provocado la muerte de muchos niños pequeños. La toxina pertussis es una exotoxina proteica que se une a los receptores celulares mediante dos dímeros y reacciona con diferentes tipos de células, como los linfocitos T, que desempeñan un papel en la inmunidad celular. [40] La PCR es una herramienta de prueba importante que puede detectar secuencias dentro del gen de la toxina de la tos ferina. Debido a que la PCR tiene una alta sensibilidad para la toxina y un tiempo de respuesta rápido, es muy eficaz para diagnosticar la tos ferina en comparación con el cultivo. [41]
Aplicaciones forenses
El desarrollo de protocolos de toma de huellas dactilares genéticas (o ADN ) basados en PCR ha tenido una aplicación generalizada en medicina forense :
En su forma más discriminatoria, las huellas genéticas pueden discriminar de manera única a cualquier persona de toda la población del mundo . Se pueden aislar muestras diminutas de ADN de la escena de un crimen y compararlas con las de los sospechosos o con las de una base de datos de ADN de pruebas anteriores o de convictos. A menudo se utilizan versiones más simples de estas pruebas para descartar rápidamente a sospechosos durante una investigación criminal. Se pueden probar pruebas de crímenes de décadas de antigüedad, confirmando o exonerando a las personas condenadas originalmente.
La tipificación forense de ADN ha sido una forma eficaz de identificar o exonerar a sospechosos de delitos gracias al análisis de las pruebas descubiertas en la escena del crimen. El genoma humano tiene muchas regiones repetitivas que se pueden encontrar dentro de secuencias genéticas o en regiones no codificantes del genoma. En concreto, hasta un 40% del ADN humano es repetitivo. [5] Hay dos categorías distintas para estas regiones repetitivas y no codificantes del genoma. La primera categoría se llama repeticiones en tándem de número variable (VNTR), que tienen entre 10 y 100 pares de bases de largo y la segunda categoría se llama repeticiones en tándem cortas (STR) y consisten en secciones repetidas de 2 a 10 pares de bases. La PCR se utiliza para amplificar varios VNTR y STR conocidos utilizando cebadores que flanquean cada una de las regiones repetitivas. Los tamaños de los fragmentos obtenidos de cualquier individuo para cada uno de los STR indicarán qué alelos están presentes. Al analizar varios STR de un individuo, se encontrará un conjunto de alelos para cada persona que estadísticamente probablemente sea único. [5] Los investigadores han identificado la secuencia completa del genoma humano. Se puede acceder fácilmente a esta secuencia a través del sitio web del NCBI y se utiliza en muchas aplicaciones de la vida real. Por ejemplo, el FBI ha compilado un conjunto de sitios de marcadores de ADN utilizados para la identificación, y estos se denominan base de datos de ADN del Sistema de índice de ADN combinado (CODIS). [5] El uso de esta base de datos permite utilizar análisis estadísticos para determinar la probabilidad de que una muestra de ADN coincida. La PCR es una herramienta analítica muy poderosa e importante para la tipificación forense de ADN porque los investigadores solo necesitan una cantidad muy pequeña del ADN objetivo para el análisis. Por ejemplo, un solo cabello humano con un folículo piloso adherido tiene suficiente ADN para realizar el análisis. De manera similar, unos pocos espermatozoides, muestras de piel debajo de las uñas o una pequeña cantidad de sangre pueden proporcionar suficiente ADN para un análisis concluyente. [5]
Formas menos discriminatorias de huellas dactilares de ADN pueden ayudar en las pruebas de paternidad de ADN , donde se compara a un individuo con sus parientes cercanos. Se puede analizar el ADN de restos humanos no identificados y compararlo con el de posibles padres, hermanos o hijos. Se pueden utilizar pruebas similares para confirmar los padres biológicos de un niño adoptado (o secuestrado). También se puede confirmar (o descartar) el verdadero padre biológico de un recién nacido .
Se ha demostrado que el diseño PCR AMGX/AMGY no sólo [ se necesita aclaración ] facilita la amplificación de secuencias de ADN de una cantidad muy minúscula de genoma. Sin embargo, también se puede utilizar para la determinación del sexo en tiempo real a partir de muestras óseas forenses. Esto proporciona una forma potente y eficaz de determinar el género en casos forenses y especímenes antiguos. [42]
Aplicaciones de investigación
La PCR se ha aplicado a muchas áreas de investigación en genética molecular:
La PCR permite la producción rápida de fragmentos cortos de ADN, incluso cuando no se conoce más que la secuencia de los dos cebadores. Esta capacidad de la PCR aumenta muchos métodos, como la generación de sondas de hibridación para la hibridación por transferencia Southern o Northern . La PCR proporciona a estas técnicas grandes cantidades de ADN puro, a veces como una sola cadena, lo que permite el análisis incluso a partir de cantidades muy pequeñas de material de partida.
La tarea de secuenciación del ADN también puede verse facilitada por la PCR. Se pueden producir fácilmente segmentos conocidos de ADN a partir de un paciente con una mutación de una enfermedad genética. Las modificaciones a la técnica de amplificación pueden extraer segmentos de un genoma completamente desconocido o pueden generar una sola hebra de un área de interés.
La PCR tiene numerosas aplicaciones para el proceso más tradicional de clonación de ADN . Puede extraer segmentos para insertarlos en un vector de un genoma más grande, que puede que sólo esté disponible en pequeñas cantidades. Utilizando un único conjunto de "cebadores vectoriales", también puede analizar o extraer fragmentos que ya se han insertado en vectores. Algunas alteraciones del protocolo de PCR pueden generar mutaciones (generales o dirigidas al sitio) de un fragmento insertado.
Los sitios etiquetados con secuencia es un proceso en el que la PCR se utiliza como indicador de que un segmento particular de un genoma está presente en un clon particular. El Proyecto Genoma Humano consideró que esta aplicación era vital para mapear los clones de cósmidos que estaban secuenciando y coordinar los resultados de diferentes laboratorios.
Una aplicación de la PCR es el análisis filogénico del ADN de fuentes antiguas , como el encontrado en huesos recuperados de neandertales , de tejidos congelados de mamuts o del cerebro de momias egipcias. [16] En algunos casos, el ADN altamente degradado de estas fuentes podría volver a ensamblarse durante las primeras etapas de amplificación.
Una aplicación común de la PCR es el estudio de patrones de expresión genética . Los tejidos (o incluso células individuales) se pueden analizar en diferentes etapas para ver qué genes se han activado o cuáles se han desactivado. Esta aplicación también puede utilizar PCR cuantitativa para cuantificar los niveles reales de expresión.
La capacidad de la PCR para amplificar simultáneamente varios loci de espermatozoides individuales [43] ha mejorado enormemente la tarea más tradicional de mapeo genético mediante el estudio de cruces cromosómicos después de la meiosis . Se han observado directamente raros eventos de cruce entre loci muy cercanos mediante el análisis de miles de espermatozoides individuales. Del mismo modo, se pueden analizar deleciones, inserciones, translocaciones o inversiones inusuales, todo ello sin tener que esperar (ni pagar) los largos y laboriosos procesos de fertilización, embriogénesis, etc.
Mutagénesis dirigida al sitio : la PCR se puede utilizar para crear genes mutantes con mutaciones elegidas por los científicos a voluntad. Estas mutaciones se pueden elegir para comprender cómo las proteínas cumplen sus funciones y para cambiar o mejorar la función de las proteínas.
Ventajas
La PCR tiene una serie de ventajas. Es bastante sencillo de entender y utilizar y produce resultados rápidamente. La técnica es muy sensible y tiene el potencial de producir de millones a miles de millones de copias de un producto específico para secuenciación, clonación y análisis. qRT-PCR comparte las mismas ventajas que la PCR, con la ventaja adicional de la cuantificación del producto sintetizado. Por lo tanto, tiene sus usos para analizar alteraciones de los niveles de expresión genética en tumores, microbios u otros estados patológicos. [27]
La PCR es una herramienta de investigación muy poderosa y práctica. La PCR está determinando la secuenciación de etiologías desconocidas de muchas enfermedades. La técnica puede ayudar a identificar la secuencia de virus previamente desconocidos relacionados con los ya conocidos y así darnos una mejor comprensión de la enfermedad en sí. Si el procedimiento se puede simplificar aún más y se pueden desarrollar sistemas sensibles de detección no radiométrica, la PCR ocupará un lugar destacado en el laboratorio clínico en los próximos años. [dieciséis]
Limitaciones
Una limitación importante de la PCR es que es necesaria información previa sobre la secuencia diana para generar los cebadores que permitirán su amplificación selectiva. [27] Esto significa que, normalmente, los usuarios de PCR deben conocer las secuencias precisas aguas arriba de la región objetivo en cada una de las dos plantillas monocatenarias para garantizar que la ADN polimerasa se una adecuadamente a los híbridos cebador-plantilla y Posteriormente genera toda la región objetivo durante la síntesis de ADN.
Como todas las enzimas, las ADN polimerasas también son propensas a errores, lo que a su vez provoca mutaciones en los fragmentos de PCR que se generan. [44]
Otra limitación de la PCR es que incluso la cantidad más pequeña de ADN contaminante puede amplificarse, lo que produce resultados engañosos o ambiguos. Para minimizar la posibilidad de contaminación, los investigadores deben reservar salas separadas para la preparación de reactivos, la PCR y el análisis del producto. Los reactivos se deben dispensar en alícuotas de un solo uso . Se deben utilizar habitualmente pipetas con émbolos desechables y puntas de pipeta extralargas. [16] Además, se recomienda garantizar que la configuración del laboratorio siga un flujo de trabajo unidireccional. Ningún material o reactivo utilizado en las salas de análisis y PCR debe llevarse nunca a la sala de preparación de PCR sin una descontaminación exhaustiva. [45]
Las muestras ambientales que contienen ácidos húmicos pueden inhibir la amplificación por PCR y generar resultados inexactos.
Variaciones
PCR alelo-específica o sistema de mutación refractaria a la amplificación (ARMS) : una técnica de diagnóstico o clonación basada en variaciones de un solo nucleótido (SNV que no deben confundirse con SNP ) (diferencias de una sola base en un paciente). Este sistema puede detectar cualquier mutación que implique un cambio de base única. Requiere conocimiento previo de una secuencia de ADN, incluidas las diferencias entre alelos , y utiliza cebadores cuyos extremos 3' abarcan el SNV (normalmente se incorpora un tampón de pares de bases alrededor del SNV). [46] La amplificación por PCR en condiciones estrictas es mucho menos eficiente en presencia de una falta de coincidencia entre la plantilla y el cebador, por lo que la amplificación exitosa con un cebador específico de SNP indica la presencia del SNP específico o pequeñas eliminaciones en una secuencia. [47] Consulte Genotipado de SNP para obtener más información.
PCR de ensamblaje o ensamblaje cíclico de la polimerasa (PCA) : síntesis artificial de secuencias largas de ADN mediante la realización de PCR en un conjunto de oligonucleótidos largos con segmentos cortos superpuestos. Los oligonucleótidos alternan entre direcciones sentido y antisentido, y los segmentos superpuestos determinan el orden de los fragmentos de PCR, produciendo así selectivamente el producto final de ADN largo. [48]
PCR asimétrica : amplifica preferentemente una cadena de ADN en una plantilla de ADN bicatenario. Se utiliza en secuenciación y sondeo de hibridación cuando se requiere la amplificación de sólo una de las dos cadenas complementarias. La PCR se lleva a cabo como de costumbre, pero con un gran exceso del cebador de la cadena objetivo de la amplificación. Debido a la amplificación lenta ( aritmética ) más adelante en la reacción, una vez que se ha agotado el cebador limitante, se requieren ciclos adicionales de PCR. [49] Una modificación reciente de este proceso, conocida como PCR lineal después de la exponencial(LATE-PCR), utiliza un cebador limitante con una temperatura de fusión más alta (Tm ) que el exceso de cebador para mantener eficiencia de la reacción a medida que la concentración limitante del cebador disminuye a mitad de la reacción. [50]
PCR convectiva : una forma pseudoisotérmica de realizar PCR. En lugar de calentar y enfriar repetidamente la mezcla de PCR, la solución se somete a un gradiente térmico. El flujo convectivo impulsado por la inestabilidad térmica resultante baraja automáticamente los reactivos de PCR de las regiones frías y calientes, lo que permite la PCR repetidamente. [51] Parámetros como las condiciones de contorno térmico y la geometría del recinto de PCR se pueden optimizar para producir una PCR robusta y rápida aprovechando la aparición de campos de flujo caóticos. [52] Esta configuración de PCR de flujo convectivo reduce significativamente los requisitos de energía del dispositivo y el tiempo de operación.
PCR de salida : un método altamente paralelo para recuperar moléculas de ADN precisas para la síntesis de genes. Una biblioteca compleja de moléculas de ADN se modifica con etiquetas flanqueantes únicas antes de una secuenciación masiva en paralelo. Los cebadores dirigidos por etiquetas permiten la recuperación de moléculas con las secuencias deseadas mediante PCR. [53]
PCR digital (dPCR) : se utiliza para medir la cantidad de una secuencia de ADN objetivo en una muestra de ADN. La muestra de ADN está muy diluida, de modo que después de realizar muchas PCR en paralelo, algunas de ellas no reciben ni una sola molécula del ADN objetivo. La concentración de ADN objetivo se calcula utilizando la proporción de resultados negativos. De ahí el nombre "PCR digital".
Amplificación dependiente de helicasa : similar a la PCR tradicional, pero utiliza una temperatura constante en lugar de pasar por ciclos de desnaturalización y hibridación/extensión. La ADN helicasa , una enzima que desenrolla el ADN, se utiliza en lugar de la desnaturalización térmica. [54]
PCR de inicio en caliente : técnica que reduce la amplificación no específica durante las etapas iniciales de configuración de la PCR. Puede realizarse manualmente calentando los componentes de la reacción a la temperatura de desnaturalización (por ejemplo, 95 °C) antes de añadir la polimerasa. [55] Se han desarrollado sistemas enzimáticos especializados que inhiben la actividad de la polimerasa a temperatura ambiente, ya sea mediante la unión de un anticuerpo [13] [56] o por la presencia de inhibidores unidos covalentemente que se disocian solo después de un paso de activación a alta temperatura. La PCR de inicio en caliente/finalización en frío se logra con nuevas polimerasas híbridas que son inactivas a temperatura ambiente y se activan instantáneamente a la temperatura de elongación.
La PCR in silico (PCR digital, PCR virtual, PCR electrónica, e-PCR) se refiere a herramientas computacionales utilizadas para calcular resultados teóricos de la reacción en cadena de la polimerasa utilizando un conjunto determinado de cebadores ( sondas ) para amplificar secuencias de ADN de un genoma o transcriptoma secuenciado. La PCR in silico se propuso como herramienta educativa para la biología molecular. [57]
PCR específica entre secuencias (ISSR): un método de PCR para la toma de huellas dactilares de ADN que amplifica regiones entre repeticiones de secuencias simples para producir una huella dactilar única de longitudes de fragmentos amplificados. [58]
PCR inversa : se utiliza comúnmente para identificar las secuencias flanqueantes alrededor de los insertos genómicos . Implica una serie de digestiones y autoligaduras del ADN , lo que da como resultado secuencias conocidas en cada extremo de la secuencia desconocida. [59]
PCR específica de metilación (MSP): desarrollada por Stephen Baylin y James G. Herman en la Facultad de Medicina Johns Hopkins, [61] y se utiliza para detectar la metilación de islas CpG en el ADN genómico. El ADN se trata primero con bisulfito de sodio, que convierte las bases de citosina no metiladas en uracilo, que los cebadores de PCR reconocen como timina. Luego se llevan a cabo dos PCR en el ADN modificado, utilizando conjuntos de cebadores idénticos excepto en cualquier isla CpG dentro de las secuencias de cebadores. En estos puntos, un conjunto de cebadores reconoce el ADN con citosinas para amplificar el ADN metilado y un conjunto reconoce el ADN con uracilo o timina para amplificar el ADN no metilado. También se puede realizar MSP mediante qPCR para obtener información cuantitativa en lugar de cualitativa sobre la metilación.
Miniprimer PCR : utiliza una polimerasa termoestable (S-Tbr) que puede extenderse desde cebadores cortos ("smalligos") tan cortos como 9 o 10 nucleótidos. Este método permite que la PCR se dirija a regiones de unión de cebadores más pequeñas y se utiliza para amplificar secuencias de ADN conservadas, como el gen de ARNr 16S (o 18S eucariótico). [62]
PCR múltiple : consta de múltiples conjuntos de cebadores dentro de una única mezcla de PCR para producir amplicones de diferentes tamaños que son específicos de diferentes secuencias de ADN. Al apuntar a múltiples genes a la vez, se puede obtener información adicional de una sola prueba que, de otro modo, requeriría varias veces más reactivos y más tiempo para realizarla. Las temperaturas de recocido para cada uno de los conjuntos de cebadores deben optimizarse para que funcionen correctamente dentro de una única reacción y los tamaños de amplicones. Es decir, la longitud de su par de bases debe ser lo suficientemente diferente como para formar bandas distintas cuando se visualizan mediante electroforesis en gel .
PCR asistida por nanopartículas (nanoPCR) : algunas nanopartículas (NP) pueden mejorar la eficiencia de la PCR (denominadas así nanoPCR), y algunas pueden incluso superar a los potenciadores de la PCR originales. Se informó que los puntos cuánticos (QD) pueden mejorar la especificidad y eficiencia de la PCR. Los nanotubos de carbono de pared simple (SWCNT) y los nanotubos de carbono de pared múltiple (MWCNT) son eficaces para mejorar la amplificación de PCR largas. El nanopolvo de carbono (CNP) puede mejorar la eficiencia de la PCR repetida y la PCR larga, mientras que se descubrió que el óxido de zinc , el dióxido de titanio y las Ag NP aumentan el rendimiento de la PCR. Los datos anteriores indicaron que las NP no metálicas conservaban una fidelidad de amplificación aceptable. Dado que muchas NP son capaces de mejorar la eficiencia de la PCR, está claro que es probable que exista un gran potencial para mejorar la tecnología nanoPCR y desarrollar productos. [63] [64]
PCR anidada : aumenta la especificidad de la amplificación del ADN, al reducir el fondo debido a la amplificación no específica del ADN. Se utilizan dos conjuntos de cebadores en dos PCR sucesivas. En la primera reacción, se utiliza un par de cebadores para generar productos de ADN que, además del objetivo previsto, también pueden consistir en fragmentos de ADN amplificados de forma no específica. Los productos se utilizan luego en una segunda PCR con un conjunto de cebadores cuyos sitios de unión son total o parcialmente diferentes y están ubicados en 3' de cada uno de los cebadores utilizados en la primera reacción. La PCR anidada suele tener más éxito a la hora de amplificar específicamente fragmentos largos de ADN que la PCR convencional, pero requiere un conocimiento más detallado de las secuencias diana.
PCR de extensión superpuesta o empalme por extensión superpuesta (SOEing) : una técnica de ingeniería genética que se utiliza para unir dos o más fragmentos de ADN que contienen secuencias complementarias. Se utiliza para unir fragmentos de ADN que contienen genes, secuencias reguladoras o mutaciones; la técnica permite la creación de construcciones de ADN largas y específicas. También puede introducir eliminaciones, inserciones o mutaciones puntuales en una secuencia de ADN. [65] [66]
PAN-AC : utiliza condiciones isotérmicas para la amplificación y puede usarse en células vivas. [67] [68]
PAN-PCR : método computacional para diseñar ensayos de tipificación de bacterias basados en datos de secuencia del genoma completo. [69]
PCR cuantitativa (qPCR): se utiliza para medir la cantidad de una secuencia objetivo (comúnmente en tiempo real). Mide cuantitativamente cantidades iniciales de ADN, ADNc o ARN. La PCR cuantitativa se usa comúnmente para determinar si una secuencia de ADN está presente en una muestra y el número de copias en la muestra. La PCR cuantitativa tiene un grado de precisión muy alto. Los métodos de PCR cuantitativa utilizan colorantes fluorescentes, como Sybr Green, EvaGreen o sondas de ADN que contienen fluoróforos , como TaqMan , para medir la cantidad de producto amplificado en tiempo real. A veces también se abrevia como RT-PCR ( PCR en tiempo real ), pero esta abreviatura debe usarse solo para PCR con transcripción inversa . qPCR son las contracciones apropiadas para la PCR cuantitativa (PCR en tiempo real).
PCR de complemento inverso (RC-PCR): permite agregar dominios funcionales o secuencias de elección de forma independiente a cualquiera de los extremos del amplicón generado en una reacción de tubo cerrado único. Este método genera cebadores específicos objetivo dentro de la reacción mediante la interacción de cebadores universales (que contienen las secuencias o dominios deseados que se agregarán) y sondas RC.
PCR de transcripción inversa ( RT-PCR ) : para amplificar ADN a partir de ARN. La transcriptasa inversa transcribe inversamente el ARN en ADNc , que luego se amplifica mediante PCR. La RT-PCR se utiliza ampliamente en la elaboración de perfiles de expresión , para determinar la expresión de un gen o para identificar la secuencia de una transcripción de ARN, incluidos los sitios de inicio y terminación de la transcripción. Si se conoce la secuencia de ADN genómico de un gen, se puede utilizar RT-PCR para mapear la ubicación de exones e intrones en el gen. El extremo 5' de un gen (correspondiente al sitio de inicio de la transcripción) normalmente se identifica mediante RACE-PCR ( Amplificación rápida de extremos de ADNc ).
PCR dependiente de RNasa H (rhPCR): una modificación de la PCR que utiliza cebadores con un bloque de extensión 3' que puede eliminarse mediante una enzima RNasa HII termoestable. Este sistema reduce los dímeros de cebadores y permite realizar reacciones multiplexadas con un mayor número de cebadores. [70]
PCR con cebador específico único (SSP-PCR): permite la amplificación de ADN bicatenario incluso cuando la información de la secuencia está disponible en un solo extremo. Este método permite la amplificación de genes para los cuales sólo se dispone de información de secuencia parcial y permite que el genoma se desplace unidireccionalmente desde regiones conocidas a regiones desconocidas del cromosoma. [71]
PCR en fase sólida : abarca múltiples significados, incluyendo amplificación polony (donde las colonias de PCR se derivan en una matriz de gel, por ejemplo), PCR en puente [72] (los cebadores están unidos covalentemente a una superficie de soporte sólido), PCR en fase sólida convencional (donde La PCR asimétrica se aplica en presencia de un cebador que lleva un soporte sólido con una secuencia que coincide con uno de los cebadores acuosos) y una PCR en fase sólida mejorada [73] (donde la PCR en fase sólida convencional se puede mejorar empleando una Tm alta y un cebador de soporte sólido anidado con aplicación opcional). de un 'paso' térmico para favorecer la imprimación del soporte sólido).
PCR suicida : normalmente se utiliza en paleogenética u otros estudios donde evitar falsos positivos y garantizar la especificidad del fragmento amplificado es la máxima prioridad. Fue descrito originalmente en un estudio para verificar la presencia del microbio Yersinia pestis en muestras dentales obtenidas de tumbas del siglo XIV de personas supuestamente muertas por la peste durante la epidemia medieval de Peste Negra . [74] El método prescribe el uso de cualquier combinación de cebadores solo una vez en una PCR (de ahí el término "suicidio"), que nunca debería haberse utilizado en ninguna reacción de PCR de control positivo, y los cebadores siempre deben apuntar a una región genómica nunca amplificada. antes en el laboratorio usando este o cualquier otro conjunto de cebadores. Esto garantiza que no haya ADN contaminante de reacciones de PCR anteriores en el laboratorio, que de otro modo podría generar falsos positivos.
PCR entrelazada térmicamente asimétrica (TAIL-PCR) : para el aislamiento de una secuencia desconocida que flanquea una secuencia conocida. Dentro de la secuencia conocida, TAIL-PCR utiliza un par anidado de cebadores con diferentes temperaturas de hibridación; Se utiliza un cebador degenerado para amplificar en la dirección opuesta a la secuencia desconocida. [75]
Touchdown PCR ( Step-down PCR ): una variante de la PCR que tiene como objetivo reducir el fondo inespecífico reduciendo gradualmente la temperatura de recocido a medida que avanza el ciclo de la PCR. La temperatura de recocido en los ciclos iniciales suele ser unos pocos grados (3-5 °C) por encima de la T m de los cebadores utilizados, mientras que en los ciclos posteriores está unos pocos grados (3-5 °C) por debajo de la T m del cebador. m . Las temperaturas más altas dan una mayor especificidad para la unión del cebador y las temperaturas más bajas permiten una amplificación más eficiente a partir de los productos específicos formados durante los ciclos iniciales. [76]
Universal Fast Walking : para caminar sobre el genoma y tomar huellas genéticas usando una PCR 'bilateral' más específica que los enfoques 'unilaterales' convencionales (usando solo un cebador específico de gen y un cebador general, lo que puede conducir a un 'ruido' artefacto) [77] en virtud de un mecanismo que implica la formación de una estructura de lazo. Los derivados optimizados de UFW son LaNe RAGE (PCR anidada dependiente de lazo para una rápida amplificación de los extremos del ADN genómico), [78] 5'RACE LaNe [79] y 3'RACE LaNe. [80]
Historia
Las enzimas resistentes al calor que son un componente clave en la reacción en cadena de la polimerasa se descubrieron en la década de 1960 como producto de una forma de vida microbiana que vivía en las aguas sobrecalentadas del Mushroom Spring de Yellowstone . [81]
Un artículo de 1971 en el Journal of Molecular Biology de Kjell Kleppe y sus compañeros de trabajo en el laboratorio de H. Gobind Khorana describió por primera vez un método de uso de un ensayo enzimático para replicar una plantilla corta de ADN con cebadores in vitro . [82] Sin embargo, esta manifestación temprana del principio básico de la PCR no recibió mucha atención en ese momento y la invención de la reacción en cadena de la polimerasa en 1983 generalmente se atribuye a Kary Mullis . [83] [ página necesaria ]
Cuando Mullis desarrolló la PCR en 1983, trabajaba en Emeryville , California, para Cetus Corporation , una de las primeras empresas de biotecnología , donde era responsable de sintetizar cadenas cortas de ADN. Mullis ha escrito que concibió la idea de la PCR mientras recorría la autopista de la costa del Pacífico una noche en su automóvil. [84] Estaba jugando en su mente con una nueva forma de analizar cambios (mutaciones) en el ADN cuando se dio cuenta de que, en cambio, había inventado un método para amplificar cualquier región del ADN a través de ciclos repetidos de duplicación impulsados por la ADN polimerasa. En Scientific American , Mullis resumió el procedimiento: "A partir de una sola molécula del material genético ADN, la PCR puede generar 100 mil millones de moléculas similares en una tarde. La reacción es fácil de ejecutar. No requiere más que un tubo de ensayo, un pocos reactivos simples y una fuente de calor." [85] Las huellas dactilares de ADN se utilizaron por primera vez para pruebas de paternidad en 1988. [86]
Mullis ha acreditado su uso de LSD como parte integral de su desarrollo de la PCR: "¿Habría inventado la PCR si no hubiera tomado LSD? Lo dudo seriamente. Podría sentarme sobre una molécula de ADN y ver pasar los polímeros. Aprendí eso en parte con drogas psicodélicas." [87]
Mullis y el bioquímico Michael Smith , que habían desarrollado otras formas esenciales de manipular el ADN, [1] recibieron conjuntamente el Premio Nobel de Química en 1993, siete años después de que Mullis y sus colegas de Cetus pusieran en práctica su propuesta por primera vez. [88] El artículo de Mullis de 1985 con RK Saiki y HA Erlich, "Enzymatic Amplification of β-globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia", la invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), recibió una Mención por Química. Premio Breakthrough de la División de Historia de la Química de la Sociedad Química Estadounidense en 2017. [89] [2]
El núcleo del método de PCR es el uso de una ADN polimerasa adecuada capaz de soportar las altas temperaturas de >90 °C (194 °F) necesarias para la separación de las dos cadenas de ADN en la doble hélice de ADN después de cada ciclo de replicación . Las ADN polimerasas utilizadas inicialmente para los experimentos in vitro que precedieron a la PCR no pudieron soportar estas altas temperaturas. [2] Por lo tanto, los primeros procedimientos para la replicación del ADN eran muy ineficientes y requerían mucho tiempo, y requerían grandes cantidades de ADN polimerasa y un manejo continuo durante todo el proceso.
El descubrimiento en 1976 de la polimerasa Taq , una ADN polimerasa purificada de la bacteria termófila Thermus acuáticos , que vive naturalmente en ambientes cálidos (50 a 80 °C (122 a 176 °F)) [14], como aguas termales, allanó el camino para camino para mejoras espectaculares del método PCR. La ADN polimerasa aislada de T. Aquaticus es estable a altas temperaturas y permanece activa incluso después de la desnaturalización del ADN, [15] obviando así la necesidad de agregar nueva ADN polimerasa después de cada ciclo. [3] Esto permitió un proceso automatizado basado en termociclador para la amplificación del ADN.
Disputas de patentes
La técnica de PCR fue patentada por Kary Mullis y asignada a Cetus Corporation , donde trabajaba Mullis cuando inventó la técnica en 1983. La enzima Taq polimerasa también estaba cubierta por patentes. Ha habido varias demandas de alto perfil relacionadas con esta técnica, incluida una demanda fallida [90] presentada por DuPont . La empresa farmacéutica suiza Hoffmann-La Roche compró los derechos de las patentes en 1992. La última de las patentes comerciales de PCR expiró en 2017. [91]
Aún está en curso una batalla por una patente relacionada con la enzima Taq polimerasa [ ¿a partir de? ] en varias jurisdicciones alrededor del mundo entre Roche y Promega . Los argumentos jurídicos se han extendido más allá de la vigencia de las patentes originales de PCR y Taq polimerasa, que expiraron el 28 de marzo de 2005. [92]
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enlaces externos
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