El recorrido con cebador es una técnica utilizada para clonar un gen (p. ej., un gen de enfermedad) a partir de sus marcadores más cercanos conocidos (p. ej., un gen conocido). Como resultado, se emplea en esfuerzos de clonación y secuenciación en plantas, hongos y mamíferos con alteraciones menores. Esta técnica, también conocida como "secuenciación dirigida", emplea una serie de reacciones de secuenciación de Sanger para confirmar la secuencia de referencia de un plásmido conocido o un producto de PCR basado en la secuencia de referencia (servicio de confirmación de secuencia) o para descubrir la secuencia desconocida de un plásmido o producto de PCR mediante el diseño de cebadores para secuenciar secciones superpuestas (servicio de descubrimiento de secuencias). [1]
La caminata con cebador es un método para determinar la secuencia de ADN hasta el rango de 1,3 a 7,0 kb, mientras que la caminata cromosómica se utiliza para producir clones de secuencias ya conocidas del gen. [2] Los fragmentos demasiado largos no se pueden secuenciar en una sola secuencia leída utilizando el método de terminación de cadena . Este método funciona dividiendo la secuencia larga en varias cortas consecutivas. El ADN de interés puede ser un inserto de plásmido , un producto de PCR o un fragmento que representa un hueco al secuenciar un genoma. El término "caminata con cebador" se utiliza cuando el objetivo principal es secuenciar el genoma. El término "cromosoma caminando" se utiliza en cambio cuando se conoce la secuencia pero no hay ningún clon de un gen. Por ejemplo, el gen de una enfermedad puede estar ubicado cerca de un marcador específico como un RFLP en la secuencia. [3] La marcha cromosómica es una técnica utilizada para clonar un gen (p. ej., gen de enfermedad) a partir de sus marcadores más cercanos conocidos (p. ej., gen conocido) y, por lo tanto, se utiliza en modificaciones moderadas en proyectos de clonación y secuenciación en plantas, hongos y animales. Para decirlo de otra manera, se utiliza para encontrar, aislar y clonar una secuencia específica que existe cerca del gen que se va a mapear. Las bibliotecas de grandes fragmentos, principalmente bibliotecas de cromosomas artificiales bacterianos, se utilizan principalmente en proyectos genómicos. Para identificar la colonia deseada y seleccionar un clon particular, primero se analiza la biblioteca con la sonda deseada. Después del cribado, el clon se superpone con la sonda y se mapean los fragmentos superpuestos. Estos fragmentos luego se utilizan como una nueva sonda (fragmentos cortos de ADN obtenidos de los extremos 3' o 5' de los clones) para identificar otros clones. Una biblioteca consta aproximadamente de 96 clones y cada clon contiene un inserto diferente. La sonda uno identifica λ1 y λ2 ya que los superpone. La sonda dos derivada de clones λ2 se utiliza para identificar λ3, y así sucesivamente. La orientación de los clones se determina mediante mapeo de restricción de los clones. De este modo, se podrían identificar nuevas regiones cromosómicas presentes en las proximidades de un gen. El recorrido cromosómico requiere mucho tiempo y el aterrizaje cromosómico es el método elegido para la identificación de genes. Este método requiere el descubrimiento de un marcador que esté firmemente relacionado con el locus mutante. [4]
Primero se secuencia el fragmento como si fuera un fragmento más corto. La secuenciación se realiza desde cada extremo utilizando cebadores universales o diseñados específicamente. Esto debería identificar las primeras 1000 bases aproximadamente. Para secuenciar completamente la región de interés, es necesario diseñar y sintetizar nuevos cebadores (complementarios de las 20 bases finales de la secuencia conocida) para obtener información de secuencia contigua. [5]
El recorrido con cebador es un ejemplo de secuenciación dirigida porque el cebador está diseñado a partir de una región conocida del ADN para guiar la secuenciación en una dirección específica. A diferencia de la secuenciación dirigida, la secuenciación rápida del ADN es una estrategia de secuenciación más rápida. [6]
Existe una técnica de los "viejos tiempos" de secuenciación del genoma. El método subyacente para la secuenciación es el método de terminación de cadena de Sanger, que puede tener longitudes de lectura entre 100 y 1000 pares de bases (dependiendo de los instrumentos utilizados). Esto significa que hay que descomponer moléculas de ADN más largas, clonarlas y posteriormente secuenciarlas. Hay dos métodos posibles. [7]
El primero se llama recorrido cromosómico (o cebador) y comienza con la secuenciación de la primera pieza. Luego se secuencia la siguiente parte (contigua) de la secuencia utilizando un cebador que es complementario al final de la primera secuencia leída y así sucesivamente. Esta técnica no requiere mucho ensamblaje, pero necesita muchos cebadores y es relativamente lenta. [8]
Para superar este problema se desarrolló el método de secuenciación de escopeta. Aquí el ADN se rompe en diferentes pedazos (no todos se rompen en el mismo lugar), se clona y se secuencia con cebadores específicos para el vector utilizado para la clonación. Esto conduce a secuencias superpuestas que luego deben ensamblarse en una sola secuencia en la computadora. Este método permite la paralelización de la secuenciación (puede preparar muchas reacciones de secuenciación al mismo tiempo y ejecutarlas), lo que hace que el proceso sea mucho más rápido y también evita la necesidad de cebadores específicos de secuencia. El desafío es organizar las secuencias en su orden, ya que las superposiciones no son tan claras aquí. Para resolver este problema, se realiza un primer borrador y luego se vuelven a secuenciar las regiones críticas utilizando otras técnicas, como el recorrido con cebador. [9]
El proceso general es el siguiente: se utiliza un cebador que coincide con el comienzo del ADN con la secuencia para sintetizar una cadena corta de ADN adyacente a la secuencia desconocida, comenzando con el cebador (ver PCR ). La nueva cadena corta de ADN se secuencia mediante el método de terminación de cadena. El extremo de la cadena secuenciada se utiliza como cebador para la siguiente parte de la larga secuencia de ADN, de ahí el término "caminar".
El método se puede utilizar para secuenciar cromosomas completos (de ahí el "caminata cromosómica"). [10] El recorrido con cebadores también fue la base para el desarrollo de la secuenciación de escopeta , que utiliza cebadores aleatorios en lugar de elegidos específicamente.
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