El salto cromosómico es una herramienta de la biología molecular que se utiliza en el mapeo físico de los genomas . Está relacionado con varias otras herramientas utilizadas para el mismo propósito, incluida la caminata cromosómica .
El salto cromosómico se utiliza para evitar regiones difíciles de clonar , como aquellas que contienen ADN repetitivo , que no se pueden mapear fácilmente mediante el recorrido cromosómico, y es útil para moverse rápidamente a lo largo de un cromosoma en busca de un gen en particular . A diferencia del paseo cromosómico, el salto cromosómico puede comenzar en un punto del cromosoma para atravesar un posible punto distante del mismo cromosoma sin clonar las secuencias intermedias. [1] Los extremos de un fragmento de ADN grande son la sección objetivo de la clonación del cromosoma que salta, mientras que la sección central se elimina mediante secuencias de manipulaciones químicas antes del paso de clonación. [2]
El salto cromosómico permite clonar dos extremos de una secuencia de ADN sin la sección media. El ADN genómico se puede digerir parcialmente utilizando endonucleasa de restricción y con la ayuda de la ADN ligasa, los fragmentos se circularizan a baja concentración. [2] [3] A partir de una secuencia conocida , se diseña un cebador para secuenciar a través de la unión circularizada. Este cebador se utiliza para saltar intervalos de 100 kb -300 kb: una secuencia a 100 kb de distancia se habría acercado a la secuencia conocida en la circularización, permite saltar y secuenciar de una manera alternativa. Por lo tanto, se pueden secuenciar secuencias a las que no se puede acceder mediante el recorrido cromosómico. [2] La marcha cromosómica también se puede utilizar desde la nueva posición de salto (en cualquier dirección) para buscar secuencias similares a genes , o se pueden utilizar saltos adicionales para avanzar más a lo largo del cromosoma. La combinación del salto cromosómico con el recorrido cromosómico a través del cromosoma permite evitar el ADN repetitivo para la búsqueda del gen objetivo.
La biblioteca de salto de cromosomas es diferente del paseo de cromosomas debido a las manipulaciones ejecutadas antes del paso de clonación . Para construir la biblioteca de salto de cromosomas, se deben identificar clones individuales que se originan a partir de puntos aleatorios en el genoma (primer protocolo básico de bibliotecas de salto general) o de los extremos de fragmentos de restricción específicos (protocolo alternativo de bibliotecas de salto específicas). [1] [4]
Un ejemplo de construcción de una biblioteca es una endonucleasa de restricción clasificada como de corte poco común , como NotI. [5] [6] Para construir y caracterizar una biblioteca basada en ADN humano digerido con NotI, se analizaron clones aleatorios mediante mapeo de restricción . [3] Debido a la amplia distribución de tamaños de fragmentos resultante de la digestión completa con NotI, la biblioteca se construyó en dos fracciones, concentración de plásmido alta y baja. [3] Los clones que poseían fragmentos finales únicos se analizaron mediante hibridación con transferencias Southern con gradiente de campo pulsado (PFG) . [3] Al examinar los resultados recopilados para digestiones simples y dobles de ADN humano con las enzimas NotI, BssHII y NruI, se creó un mapa de restricción con una región de 850 kb que contenía los clones de enlace y salto. [3] Además, los fragmentos NotI de saltos de 250 y 350 kb fueron evidentes en los dos clones finales derivados correspondientes a distancias genéticas de 0,25 y 0,35 cM. [3]
Las ventajas del salto cromosómico son:
Sin embargo, a pesar de estas ventajas, el salto cromosómico todavía está restringido por la capacidad del vector de clonación , que es la distancia de los extremos de los dos fragmentos que puede ser de aproximadamente cientos de kilobases. [2] Además, debido a que el salto no clona el ADN interviniente, sería necesario realizar un recorrido cromosómico para identificar todos los genes presentes en el ADN. [7] Independientemente, todavía se considera beneficioso debido a la posibilidad de saltar más de cien kilobases en comparación con la caminata cromosómica.
Las bibliotecas de salto de cromosomas ayudan a abordar la complicación de las técnicas de clonación estándar con grandes distancias moleculares. Este proceso permitió la posibilidad de utilizar la biblioteca de saltos cromosómicos para otros trastornos genéticos que requieren saltos de 100 kilobases. [4] Particularmente para trastornos genéticos como la fibrosis quística , su gen está ubicado en el cromosoma 7 humano , pudo utilizar la biblioteca de salto de cromosomas para buscar un clon saltador, conocido como oncogén. [4] La identificación de la fibrosis quística fue complicada debido a que existe en genes eucariotas que se componen de segmentos codificantes (exones) y no codificantes (intrones) , donde los intrones son de tamaño pequeño, lo que dificulta su detección. [7] Otra lucha para reconocer el gen de la fibrosis quística se debe a que las células de los mamíferos contienen una variedad de ADN repetitivo que puede conducir a una clonación incorrecta y al bloqueo de la replicación del ADN y puede causar inestabilidad. [8] Ambas complicaciones, las técnicas de clonación tradicionales no pueden procesar porque una gran cantidad de exones tendría que ser visible para producir una señal para que se identifique el gen de la fibrosis quística y el ADN tendría que estar libre de elementos repetitivos. [7]