Los oligonucleótidos son moléculas cortas de ADN o ARN , oligómeros , que tienen una amplia gama de aplicaciones en pruebas genéticas , investigación y medicina forense . Comúnmente elaborados en el laboratorio mediante síntesis química en fase sólida , [1] estos pequeños fragmentos de ácidos nucleicos pueden fabricarse como moléculas monocatenarias con cualquier secuencia especificada por el usuario y, por lo tanto, son vitales para la síntesis de genes artificiales , la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ), secuenciación de ADN , clonación molecular y como sondas moleculares . En la naturaleza, los oligonucleótidos generalmente se encuentran como pequeñas moléculas de ARN que funcionan en la regulación de la expresión genética (por ejemplo, microARN ), [2] o son intermediarios de degradación derivados de la descomposición de moléculas de ácido nucleico más grandes.
Los oligonucleótidos se caracterizan por la secuencia de residuos de nucleótidos que forman la molécula completa. La longitud del oligonucleótido suele indicarse con " -mer " (del griego meros , "parte"). Por ejemplo, un oligonucleótido de seis nucleótidos (nt) es un hexámero, mientras que uno de 25 nt normalmente se denominaría "25-mer". Los oligonucleótidos se unen fácilmente, de una manera específica de secuencia, a sus respectivos oligonucleótidos complementarios , ADN o ARN para formar dúplex o, con menos frecuencia, híbridos de un orden superior. Esta propiedad básica sirve como base para el uso de oligonucleótidos como sondas para detectar secuencias específicas de ADN o ARN. Ejemplos de procedimientos que utilizan oligonucleótidos incluyen microarrays de ADN , transferencias Southern , análisis ASO , [3] hibridación fluorescente in situ (FISH), PCR y la síntesis de genes artificiales.
Los oligonucleótidos están compuestos de 2'-desoxirribonucleótidos (oligodesoxirribonucleótidos), que pueden modificarse en la columna vertebral o en la posición 2' del azúcar para lograr diferentes efectos farmacológicos. Estas modificaciones confieren nuevas propiedades a los oligonucleótidos y los convierten en un elemento clave en la terapia antisentido . [4] [5]
Los oligonucleótidos se sintetizan químicamente utilizando bloques de construcción, fosforamiditas protegidas de nucleósidos naturales o químicamente modificados o, en menor medida, de compuestos no nucleosídicos. El ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos avanza en la dirección 3' a 5' siguiendo un procedimiento de rutina denominado "ciclo sintético". La finalización de un único ciclo sintético da como resultado la adición de un residuo de nucleótido a la cadena en crecimiento. Un rendimiento inferior al 100% de cada paso sintético y la aparición de reacciones secundarias establecen límites prácticos a la eficiencia del proceso. En general, las secuencias de oligonucleótidos suelen ser cortas (de 13 a 25 nucleótidos de longitud). [6] La longitud máxima de los oligonucleótidos sintéticos apenas supera los 200 residuos de nucleótidos. Se pueden utilizar HPLC y otros métodos para aislar productos con la secuencia deseada. [ cita necesaria ]
La creación de oligonucleótidos cortos químicamente estables fue el primer desafío en el desarrollo de terapias ASO. Los oligonucleótidos naturales se degradan fácilmente por las nucleasas, una enzima que escinde los nucleótidos y es abundante en todo tipo de células. [7] Las secuencias cortas de oligonucleótidos también tienen afinidades de unión intrínsecas débiles, lo que contribuye a su degradación in vivo. [8]
Los análogos de nucleótidos nucleósidos organotiofosfato (PS) confieren a los oligonucleótidos algunas propiedades beneficiosas. Las propiedades beneficiosas clave que las cadenas principales de PS otorgan a los nucleótidos son la identificación de diastereoisómeros de cada nucleótido y la capacidad de seguir fácilmente reacciones que involucran a los nucleótidos de fosforotioato, lo cual es útil en la síntesis de oligonucleótidos. [9] Las modificaciones de la columna vertebral de PS a los oligonucleótidos los protegen contra la degradación no deseada por parte de enzimas. [10] La modificación de la columna vertebral de nucleótidos se usa ampliamente porque se puede lograr con relativa facilidad y precisión en la mayoría de los nucleótidos. [9] Se informó que las modificaciones fluorescentes en los extremos 5' y 3' de los oligonucleótidos evalúan las estructuras, dinámicas e interacciones de los oligonucleótidos con respecto al medio ambiente. [11]
Otra modificación que es útil para aplicaciones médicas de oligonucleótidos son las modificaciones del azúcar 2' . "La modificación del azúcar en la posición 2' aumenta la eficacia de los oligonucleótidos al mejorar las capacidades de unión al objetivo de los oligonucleótidos, específicamente en terapias con oligonucleótidos antisentido" . [8] También disminuyen la unión a proteínas no específicas, lo que aumenta la precisión de apuntar a proteínas específicas. [8] Dos de las modificaciones más utilizadas son el 2'-O-metilo y el 2'-O-metoxietilo. [8] También se informaron modificaciones fluorescentes en la nucleobase. [11]
Los oligonucleótidos antisentido (ASO) son cadenas simples de ADN o ARN que son complementarias a una secuencia elegida. [6] En el caso del ARN antisentido , previenen la traducción de proteínas de ciertas cadenas de ARN mensajero uniéndose a ellas, en un proceso llamado hibridación . [12] Los oligonucleótidos antisentido se pueden utilizar para dirigirse a un ARN complementario específico (codificante o no codificante ). Si se produce la unión, este híbrido puede ser degradado por la enzima RNasa H. [12] La RNasa H es una enzima que hidroliza el ARN y, cuando se utiliza en una aplicación de oligonucleótidos antisentido, produce una regulación negativa del 80-95 % de la expresión del ARNm. [6]
El uso de oligonucleótidos antisentido de morfolino para la eliminación de genes en vertebrados , que ahora es una técnica estándar en biología del desarrollo y se utiliza para estudiar la expresión y la función genética alteradas, fue desarrollado por primera vez por Janet Heasman utilizando Xenopus . [13] Los medicamentos Morfolino aprobados por la FDA incluyen eteplirsen y golodirsen . Los oligonucleótidos antisentido también se han utilizado para inhibir la replicación del virus de la influenza en líneas celulares. [14] [15]
Las enfermedades neurodegenerativas que son el resultado de una única proteína mutante son buenos objetivos para las terapias con oligonucleótidos antisentido debido a su capacidad para apuntar y modificar secuencias de ARN muy específicas con alta selectividad. [3] Muchas enfermedades genéticas, incluidas la enfermedad de Huntington , la enfermedad de Alzheimer , la enfermedad de Parkinson y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), se han relacionado con alteraciones del ADN que dan como resultado secuencias de ARN incorrectas y proteínas mal traducidas que tienen un efecto fisiológico tóxico. [dieciséis]
La captación/internalización celular sigue representando el mayor obstáculo para lograr terapias exitosas con oligonucleótidos (ON). Una absorción sencilla, como ocurre con la mayoría de los fármacos de molécula pequeña, se ve obstaculizada por la estructura polianiónica y el tamaño molecular de los ON. Los mecanismos exactos de absorción y tráfico intracelular hacia el lugar de acción aún no están claros. Además, pequeñas diferencias en la estructura/modificación de ON (vide supra) y la diferencia en el tipo de célula conducen a enormes diferencias en la absorción. Se cree que la absorción celular se produce por diferentes vías después de la adsorción de ON en la superficie celular. En particular, los estudios muestran que la mayoría de las células de cultivos de tejidos absorben fácilmente ASO (enlace fosforotioto) de forma no productiva, lo que significa que no se observa ningún efecto antisentido. Por el contrario, la conjugación de ASO con ligandos reconocidos por receptores acoplados a G conduce a una mayor captación productiva. [17] Además de esa clasificación (no productiva versus productiva), la internalización celular se produce principalmente de una manera dependiente de la energía (endocitosis mediada por receptores), pero no se puede descartar la difusión pasiva independiente de la energía (gimnosis). Después de pasar la membrana celular, los agentes terapéuticos ON se encapsulan en endosomas tempranos que se transportan hacia endosomas tardíos que finalmente se fusionan con lisosomas que contienen enzimas degradantes a pH bajo. [18] Para ejercer su función terapéutica, el ON necesita escapar del endosoma antes de su degradación. Actualmente no existe un método universal para superar los problemas de administración, captación celular y escape endosómico, pero existen varios enfoques que se adaptan a células específicas y sus receptores. [19]
Una conjugación de agentes terapéuticos ON con una entidad responsable del reconocimiento/captación celular no solo aumenta la absorción (vide supra) sino que también se cree que disminuye la complejidad de la absorción celular ya que entonces está implicado principalmente un mecanismo (idealmente conocido). [18] Esto se ha logrado con conjugados ON de molécula pequeña, por ejemplo, que contienen una N-acetil galactosamina que se dirige a los receptores de los hepatocitos . [20] Estos conjugados son un excelente ejemplo para obtener una mayor absorción celular junto con una administración dirigida, ya que los receptores correspondientes se sobreexpresan en las células diana, lo que conduce a una terapia dirigida (compárese con los conjugados anticuerpo-fármaco que explotan los receptores sobreexpresados en las células cancerosas). [19] Otra entidad ampliamente utilizada y muy investigada para la administración dirigida y una mayor absorción celular de oligonucleótidos son los anticuerpos .
Las alquilamidas se pueden utilizar como fases estacionarias cromatográficas . [21] Esas fases han sido investigadas para la separación de oligonucleótidos. [22] La cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa de pares iónicos se utiliza para separar y analizar los oligonucleótidos después de la síntesis automatizada. [23]
Se puede utilizar una mezcla de ácido 5-metoxisalicílico y espermina como matriz para el análisis de oligonucleótidos en espectrometría de masas MALDI . [24] La espectrometría de masas por ionización por electropulverización (ESI-MS) también es una poderosa herramienta para caracterizar la masa de oligonucleótidos. [25]
Los microarrays de ADN son una aplicación analítica útil de oligonucleótidos. En comparación con los microarrays de ADNc estándar , los microarrays basados en oligonucleótidos tienen una especificidad más controlada sobre la hibridación y la capacidad de medir la presencia y prevalencia de secuencias poliadeniladas o empalmadas alternativamente . [26] Un subtipo de micromatrices de ADN puede describirse como sustratos (nylon, vidrio, etc.) a los que se han unido oligonucleótidos a alta densidad. [27] Hay una serie de aplicaciones de microarrays de ADN dentro de las ciencias biológicas. [ cita necesaria ]
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