El Northern blot , o RNA blot, [1] es una técnica utilizada en la investigación de biología molecular para estudiar la expresión génica mediante la detección de ARN (o ARNm aislado ) en una muestra. [2] [3]
Con la transferencia Northern es posible observar el control celular sobre la estructura y función determinando las tasas de expresión genética particulares durante la diferenciación y la morfogénesis , así como en condiciones anormales o enfermas. [4] La transferencia Northern implica el uso de electroforesis para separar muestras de ARN por tamaño y la detección con una sonda de hibridación complementaria a parte o a la secuencia objetivo completa. Estrictamente hablando, el término "transferencia Northern" se refiere específicamente a la transferencia capilar de ARN desde el gel de electroforesis a la membrana de transferencia. Sin embargo, todo el proceso se conoce comúnmente como transferencia Northern. [5] La técnica de transferencia Northern fue desarrollada en 1977 por James Alwine, David Kemp y George Stark en la Universidad de Stanford . [6] La transferencia Northern toma su nombre de su similitud con la primera técnica de transferencia, la transferencia Southern , llamada así en honor al biólogo Edwin Southern . [2] La principal diferencia es que en la transferencia Northern se analiza el ARN, en lugar del ADN . [7]
Un procedimiento de transferencia general [5] comienza con la extracción del ARN total de una muestra de tejido homogeneizada o de células. Luego, el ARNm eucariota se puede aislar mediante el uso de cromatografía en oligo (dT) celulosa para aislar solo aquellos ARN con una cola poli(A) . [8] [9] Las muestras de ARN luego se separan mediante electroforesis en gel. Dado que los geles son frágiles y las sondas no pueden ingresar a la matriz, las muestras de ARN, ahora separadas por tamaño, se transfieren a una membrana de nailon a través de un sistema de transferencia capilar o al vacío.
Una membrana de nailon con carga positiva es la más eficaz para su uso en la transferencia Northern, ya que los ácidos nucleicos cargados negativamente tienen una alta afinidad por ella. El tampón de transferencia utilizado para la transferencia generalmente contiene formamida porque reduce la temperatura de hibridación de la interacción sonda-ARN, eliminando así la necesidad de altas temperaturas, que podrían causar la degradación del ARN. [10] Una vez que el ARN se ha transferido a la membrana, se inmoviliza mediante un enlace covalente a la membrana mediante luz ultravioleta o calor. Una vez marcada una sonda, se hibrida con el ARN de la membrana. Las condiciones experimentales que pueden afectar la eficiencia y especificidad de la hibridación incluyen fuerza iónica, viscosidad, longitud del dúplex, pares de bases no coincidentes y composición de bases. [11] La membrana se lava para garantizar que la sonda se haya unido específicamente y para evitar que surjan señales de fondo. Las señales híbridas se detectan luego mediante una película de rayos X y pueden cuantificarse mediante densitometría . Para crear controles para comparar en una transferencia Northern, se pueden usar muestras que no muestren el producto genético de interés después de la determinación mediante microarrays o RT-PCR . [11]
Las muestras de ARN se separan más comúnmente en geles de agarosa que contienen formaldehído como agente desnaturalizante del ARN para limitar la estructura secundaria. [11] [12] Los geles se pueden teñir con bromuro de etidio (EtBr) y observarse bajo luz ultravioleta para observar la calidad y cantidad de ARN antes de la transferencia. [11] La electroforesis en gel de poliacrilamida con urea también se puede utilizar en la separación de ARN, pero se utiliza más comúnmente para ARN o microARN fragmentados. [13] A menudo se pasa una escalera de ARN junto con las muestras en un gel de electroforesis para observar el tamaño de los fragmentos obtenidos, pero en las muestras de ARN total las subunidades ribosómicas pueden actuar como marcadores de tamaño. [11] Dado que la subunidad ribosomal grande es 28S (aproximadamente 5 kb) y la subunidad ribosómica pequeña es 18S (aproximadamente 2 kb), aparecen dos bandas prominentes en el gel, la más grande con casi el doble de intensidad que la más pequeña. [11] [14]
Las sondas para transferencia Northern están compuestas por ácidos nucleicos con una secuencia complementaria a todo o parte del ARN de interés. Pueden ser ADN, ARN u oligonucleótidos con un mínimo de 25 bases complementarias a la secuencia diana. [5] Las sondas de ARN (ribosondas) que se transcriben in vitro son capaces de soportar pasos de lavado más rigurosos evitando parte del ruido de fondo. [11] Comúnmente el ADNc se crea con cebadores marcados para que la secuencia de ARN de interés actúe como sonda en la transferencia Northern. [15] Las sondas deben marcarse con isótopos radiactivos ( 32 P) o con quimioluminiscencia en la que la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano picante (HRP) descomponen los sustratos quimioluminiscentes produciendo una emisión de luz detectable. [16] El marcaje quimioluminiscente puede ocurrir de dos maneras: o la sonda está unida a la enzima, o la sonda está marcada con un ligando (por ejemplo, biotina ) para el cual el ligando (por ejemplo, avidina o estreptavidina ) está unido a la enzima ( por ejemplo, HRP). [11] La película de rayos X puede detectar señales radiactivas y quimioluminiscentes y muchos investigadores prefieren las señales quimioluminiscentes porque son más rápidas, más sensibles y reducen los riesgos para la salud que conllevan las etiquetas radiactivas. [16] La misma membrana se puede sondear hasta cinco veces sin una pérdida significativa del ARN objetivo. [10]
La transferencia Northern permite observar el patrón de expresión de un gen particular entre tejidos, órganos, etapas de desarrollo, niveles de estrés ambiental, infección por patógenos y durante el transcurso del tratamiento. [9] [15] [17] La técnica se ha utilizado para mostrar la sobreexpresión de oncogenes y la regulación negativa de genes supresores de tumores en células cancerosas en comparación con el tejido "normal", [11] así como la expresión genética en el rechazo de órganos trasplantados. [18] Si se observa un gen regulado positivamente por una gran cantidad de ARNm en la transferencia Northern, la muestra se puede secuenciar para determinar si los investigadores conocen el gen o si se trata de un hallazgo novedoso. [18] Los patrones de expresión obtenidos en determinadas condiciones pueden proporcionar información sobre la función de ese gen. Dado que el ARN se separa primero por tamaño, si solo se utiliza un tipo de sonda, la variación en el nivel de cada banda en la membrana puede proporcionar información sobre el tamaño del producto, sugiriendo productos de empalme alternativos del mismo gen o motivos de secuencia repetitivos. [8] [14] La variación en el tamaño de un producto genético también puede indicar eliminaciones o errores en el procesamiento de la transcripción. Al alterar el objetivo de la sonda utilizada a lo largo de la secuencia conocida, es posible determinar qué región del ARN falta. [2]
El análisis de la expresión génica se puede realizar mediante varios métodos diferentes, incluidos RT-PCR, ensayos de protección de RNasa, micromatrices, RNA-Seq , análisis en serie de la expresión génica (SAGE) y transferencia Northern. [4] [5] Los microarrays se utilizan con bastante frecuencia y suelen ser consistentes con los datos obtenidos de las transferencias Northern; sin embargo, a veces la transferencia Northern puede detectar pequeños cambios en la expresión genética que los microarrays no pueden. [19] La ventaja que tienen los microarrays sobre las transferencias Northern es que se pueden visualizar miles de genes a la vez, mientras que la transferencia Northern generalmente analiza uno o un pequeño número de genes. [17] [19]
Un problema en la transferencia Northern es a menudo la degradación de la muestra por las RNasas (tanto endógenas de la muestra como a través de la contaminación ambiental), que puede evitarse mediante la esterilización adecuada del material de vidrio y el uso de inhibidores de la RNasa como DEPC ( dietilpirocarbonato ). [5] Los productos químicos utilizados en la mayoría de las transferencias Northern pueden ser un riesgo para el investigador, ya que el formaldehído, el material radiactivo, el bromuro de etidio, el DEPC y la luz ultravioleta son dañinos bajo ciertas exposiciones. [11] En comparación con la RT-PCR, la transferencia Northern tiene una sensibilidad baja, pero también una especificidad alta, lo cual es importante para reducir los resultados falsos positivos. [11]
Las ventajas de utilizar la transferencia Northern incluyen la detección del tamaño del ARN, la observación de productos de empalme alternativos, el uso de sondas con homología parcial, la calidad y cantidad del ARN se puede medir en el gel antes de la transferencia y las membranas se pueden almacenar. y reprobado durante años después de borrarlo. [11]
Para la transferencia Northern para la detección de ARNm de acetilcolinesterasa , se comparó la técnica no radiactiva con una técnica radiactiva y se encontró que era tan sensible como la radiactiva, pero no requiere protección contra la radiación y requiere menos tiempo. [20]
Los investigadores utilizan ocasionalmente una variante del procedimiento conocido como transferencia Northern inversa. En este procedimiento, el ácido nucleico sustrato (que está fijado a la membrana) es una colección de fragmentos de ADN aislados y la sonda es ARN extraído de un tejido y marcado radiactivamente. El uso de micromatrices de ADN , que se han generalizado a finales de los años 1990 y principios de los 2000, se parece más al procedimiento inverso, en el sentido de que implican el uso de fragmentos de ADN aislados fijados a un sustrato y la hibridación con una sonda hecha de ARN celular. . Así, el procedimiento inverso, aunque originalmente poco común, permitió que el análisis Northern evolucionara hacia un perfil de expresión génica , en el que se puede controlar la expresión de muchos (posiblemente todos) los genes de un organismo.
