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Fosfatasa alcalina

La enzima fosfatasa alcalina (ALP, fenilfosfatasa alcalina) es una fosfatasa con la función fisiológica de desfosforilar compuestos. La enzima se encuentra en una multitud de organismos, tanto procariotas como eucariotas , con la misma función general, pero en diferentes formas estructurales adecuadas al entorno en el que funcionan. La fosfatasa alcalina se encuentra en el espacio periplásmico de la bacteria E. coli . Esta enzima es termoestable y tiene su máxima actividad a pH alto. En los seres humanos, se encuentra en muchas formas dependiendo de su origen en el cuerpo: desempeña un papel integral en el metabolismo en el hígado y el desarrollo en el esqueleto. Debido a su prevalencia generalizada en estas áreas, los diagnosticadores utilizan su concentración en el torrente sanguíneo como biomarcador para ayudar a determinar diagnósticos como hepatitis u osteomalacia . [2]

El nivel de fosfatasa alcalina en la sangre se controla mediante la prueba ALP, que a menudo forma parte de los análisis de sangre de rutina. Los niveles de esta enzima en sangre dependen de factores como la edad, el sexo o el tipo de sangre. [2] Los niveles sanguíneos de fosfatasa alcalina también aumentan de dos a cuatro veces durante el embarazo. Esto es el resultado de la fosfatasa alcalina adicional producida por la placenta y el hígado. [3] [4] Además, los niveles anormales de fosfatasa alcalina en la sangre podrían indicar problemas relacionados con el hígado, la vesícula biliar o los huesos. Los tumores e infecciones renales, así como la desnutrición, también han mostrado niveles anormales de fosfatasa alcalina en la sangre. [2] Los niveles de fosfatasa alcalina en una célula se pueden medir mediante un proceso llamado "El método de puntuación". Por lo general, se toma y tiñe un frotis de sangre para clasificar cada leucocito en "índices de fosfatasa alcalina leucocitaria" específicos. Este marcador está diseñado para distinguir los leucocitos y determinar diferentes actividades enzimáticas a partir del grado de tinción de cada muestra. [5]

Bacteriano

En las bacterias gramnegativas , como Escherichia coli , la fosfatasa alcalina se encuentra en el espacio periplásmico , externo a la membrana celular interna y dentro de la porción de peptidoglicano de la pared celular. Dado que la brecha periplásmica es más propensa a la variación ambiental que la célula interna, la fosfatasa alcalina es adecuadamente resistente a la inactivación, desnaturalización o degradación . Esta característica de la enzima es poco común en muchas otras proteínas. [6]

La estructura y función precisas de la isoenzima en E. coli está orientada únicamente a suministrar una fuente de fosfato inorgánico cuando el medio ambiente carece de este metabolito. Luego, los fosfatos inorgánicos se unen a proteínas transportadoras que los entregan a un sistema de transporte específico de alta afinidad, conocido como sistema de transporte específico de fosfato, que transporta el fosfato a través de la membrana citoplasmática. [7]

Mientras que la membrana externa de E. coli contiene porinas que son permeables a los compuestos fosforilados, la membrana interna no. Surge el problema de cómo transportar dichos compuestos a través de la membrana interna hasta el citosol. La fuerte carga aniónica de los grupos fosfato junto con el resto del compuesto hace que los compuestos fosforilados sean muy inmiscibles en la región no polar de la bicapa. La solución surge al escindir el grupo fosfato del compuesto a través de ALP. [8] para la translocación al citosol, [9] El objetivo principal de la desfosforilación por la fosfatasa alcalina es aumentar la velocidad de difusión de las moléculas fosforiladas en las células e inhibir su difusión. [10]

La fosfatasa alcalina es una enzima dimérica que contiene zinc con un PM: 86.000 Da, cada subunidad contiene 429 aminoácidos con cuatro residuos de cisteína que unen las dos subunidades. [11]  La fosfatasa alcalina contiene cuatro iones Zn y dos iones Mg, con Zn ocupando los sitios activos A y B, y Mg ocupando el sitio C, por lo que la fosfatasa alcalina nativa completamente activa se conoce como enzima (Zn A Zn B Mg C ) 2 . . El mecanismo de acción de la fosfatasa alcalina implica la coordinación geométrica del sustrato entre los iones Zn en los sitios activos. [11]

La fosfatasa alcalina en E. coli es excepcionalmente soluble y activa en condiciones de temperatura elevada, como 80 °C. Debido a la energía cinética inducida por esta temperatura, los débiles enlaces de hidrógeno y las interacciones hidrofóbicas de las proteínas comunes se degradan y, por lo tanto, se fusionan y precipitan. Sin embargo, tras la dimerización de la fosfatasa alcalina, los enlaces que mantienen sus estructuras secundaria y terciaria quedan efectivamente enterrados de manera que no se ven tan afectados a esta temperatura. Además, incluso a temperaturas más elevadas, como 90 °C, la fosfatasa alcalina tiene la característica inusual de desnaturalización inversa. Debido a esto, aunque finalmente se desnaturaliza a aproximadamente 90 °C, tiene la capacidad adicional de reformar con precisión sus enlaces y volver a su estructura y función originales una vez que se enfría. [6]

La fosfatasa alcalina en E. coli se encuentra en el espacio periplásmico y, por lo tanto, puede liberarse mediante técnicas que debilitan la pared celular y liberan la proteína. Debido a la ubicación de la enzima y a la disposición de las proteínas de la enzima, la enzima está en solución con una cantidad menor de proteínas que la que hay en otra parte de la célula. [12] La estabilidad térmica de las proteínas también se puede aprovechar al aislar esta enzima (mediante desnaturalización térmica). Además, la fosfatasa alcalina se puede analizar usando fosfato de p-nitrofenilo. Una reacción en la que la fosfatasa alcalina desfosforila el sustrato no específico, p-nitrofenilfosfato para producir p-nitrofenol (PNP) y fosfato inorgánico. El color amarillo del PNP y su λ max a 410 permiten que la espectrofotometría determine la actividad enzimática. [13] Algunas complejidades de la regulación y el metabolismo bacteriano sugieren que otros propósitos, más sutiles, de la enzima también pueden desempeñar un papel para la célula. Sin embargo, en el laboratorio , los mutantes de Escherichia coli que carecen de fosfatasa alcalina sobreviven bastante bien, al igual que los mutantes que no pueden detener la producción de fosfatasa alcalina. [14]

El pH óptimo para la actividad de la enzima E. coli es 8,0 [15] , mientras que el pH óptimo de la enzima bovina es ligeramente superior a 8,5. [16] La fosfatasa alcalina representa el 6% de todas las proteínas en las células desreprimidas. [17]

Complementación intragénica

Cuando varias copias de un polipéptido codificado por un gen forman un agregado, esta estructura proteica se denomina multímero. Cuando se forma un multímero a partir de polipéptidos producidos por dos alelos mutantes diferentes de un gen particular, el multímero mixto puede exhibir una mayor actividad funcional que los multímeros no mezclados formados por cada uno de los mutantes solo. En tal caso, el fenómeno se denomina complementación intragénica . La fosfatasa alcalina de E. coli , una enzima dímera, exhibe complementación intragénica. [18]

Uso en investigación

Al cambiar los aminoácidos de la enzima fosfatasa alcalina de tipo salvaje producida por Escherichia coli , se crea una fosfatasa alcalina mutante que no sólo tiene un aumento de 36 veces en la actividad enzimática, sino que también conserva la estabilidad térmica. [19] Los usos típicos en el laboratorio de las fosfatasas alcalinas incluyen la eliminación de monoésteres de fosfato para evitar la autoligación, lo cual no es deseable durante la clonación de ADN plasmídico . [20]

Las fosfatasas alcalinas comunes utilizadas en la investigación incluyen:

La fosfatasa alcalina intestinal humana muestra alrededor del 80% de homología con la enzima intestinal bovina, lo que confirma sus orígenes evolutivos compartidos. Esa misma enzima bovina tiene más del 70% de homología con la enzima placentaria humana. Sin embargo, la enzima hepática humana y la enzima placentaria sólo comparten un 20% de homología a pesar de sus similitudes estructurales. [23]

La fosfatasa alcalina se ha convertido en una herramienta útil en los laboratorios de biología molecular , ya que el ADN normalmente posee grupos fosfato en el extremo 5' . La eliminación de estos fosfatos evita que el ADN se ligue (el extremo 5' se une al extremo 3' ), manteniendo así las moléculas de ADN lineales hasta el siguiente paso del proceso para el que se están preparando; Además, la eliminación de los grupos fosfato permite el radiomarcaje (reemplazo por grupos fosfato radiactivos) para medir la presencia del ADN marcado en pasos adicionales del proceso o experimento. Para estos fines, la fosfatasa alcalina del camarón es la más útil, ya que es la más fácil de inactivar una vez que ha hecho su trabajo. [ cita necesaria ]

Otro uso importante de la fosfatasa alcalina es como marcador para inmunoensayos enzimáticos . [ cita necesaria ]

Las células madre pluripotentes indiferenciadas tienen niveles elevados de fosfatasa alcalina en su membrana celular , por lo que se utiliza la tinción con fosfatasa alcalina para detectar estas células y probar la pluripotencia (es decir, células madre embrionarias o células de carcinoma embrionario ). [24]

Existe una correlación positiva entre los niveles séricos de fosfatasa alcalina ósea y la formación ósea en humanos, aunque no se recomienda su uso como biomarcador en la práctica clínica. [25]

Industria láctea

La fosfatasa alcalina se utiliza comúnmente en la industria láctea como indicador de una pasteurización exitosa. Esto se debe a que la bacteria más estable al calor que se encuentra en la leche , Mycobacterium paratuberculosis , es destruida por temperaturas inferiores a las necesarias para desnaturalizar la enzima. Por tanto, su presencia es ideal para indicar una pasteurización fallida. [26] [27]

La verificación de la pasteurización normalmente se realiza midiendo la fluorescencia de una solución que se vuelve fluorescente cuando se expone a la fosfatasa alcalina activa. Los productores de leche del Reino Unido exigen ensayos de fluorimetría para demostrar que la fosfatasa alcalina ha sido desnaturalizada, [28] ya que las pruebas de p-nitrofenilfosfato no se consideran lo suficientemente precisas para cumplir con los estándares de salud.

Alternativamente , se puede utilizar el cambio de color de p -nitrofenilfosfato como sustrato en una solución tamponada (prueba de Aschaffenburg Mullen). [29] La leche cruda normalmente produciría una coloración amarilla en un par de minutos, mientras que la leche pasteurizada adecuadamente no debería mostrar cambios. Hay excepciones, como en el caso de las fosfatasas alcalinas termoestables producidas por algunas bacterias, pero estas bacterias no deberían estar presentes en la leche. [ cita necesaria ]

Inhibidores

Todas las isoenzimas de fosfatasa alcalina de los mamíferos, excepto las placentarias (PALP y SEAP), son inhibidas por la homoarginina y, de manera similar, todas, excepto las intestinales y placentarias, son bloqueadas por el levamisol . [30] El fosfato es otro inhibidor que inhibe competitivamente la fosfatasa alcalina. [31]

Otro ejemplo conocido de inhibidor de fosfatasa alcalina es el ácido [(4-nitrofenil)metil]fosfónico. [32]

En suelos contaminados con metales, la fosfatasa alcalina es inhibida por el cadmio. Además, la temperatura potencia la inhibición del Cd sobre la actividad enzimática, lo que se muestra en los valores crecientes de K m . [33]

Humano

Fisiología

En los seres humanos, la fosfatasa alcalina está presente en todos los tejidos del cuerpo, pero se concentra especialmente en el hígado , las vías biliares , los riñones , los huesos , la mucosa intestinal y la placenta . En el suero predominan dos tipos de isoenzimas de fosfatasa alcalina : esquelética y hepática. Durante la infancia la mayoría de las fosfatasas alcalinas son de origen esquelético. [34] Los humanos y la mayoría de los demás mamíferos contienen las siguientes isoenzimas de fosfatasa alcalina: [ cita necesaria ]

Cuatro genes codifican las cuatro isoenzimas. El gen de la fosfatasa alcalina no específica de tejido se encuentra en el cromosoma 1 y los genes de las otras tres isoformas se encuentran en el cromosoma 2 . [35]

Fosfatasa alcalina intestinal

La fosfatasa alcalina intestinal es secretada por los enterocitos y parece desempeñar un papel fundamental en la homeostasis y la protección intestinal [36] [37] , así como en la supresión de la inflamación [38] mediante la represión del receptor tipo Toll (TLR) -4 . cascada inflamatoria dependiente y dependiente de MyD88 . [39] Desfosforila ligandos microbianos tóxicos/inflamatorios como los lipopolisacáridos (LPS), [40] dinucleótidos de citosina-guanina no metilados, flagelina y nucleótidos extracelulares como el difosfato de uridina o ATP. La desfosforilación de LPS por IAP puede reducir la gravedad de la infección por Salmonella tryphimurium y Clostridioides difficile y restaurar la microbiota intestinal normal. [40] Por lo tanto, la expresión alterada de IAP se ha implicado en enfermedades inflamatorias crónicas como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). [40] [41] También parece regular la absorción de lípidos [42] y la secreción de bicarbonato [43] en la mucosa duodenal, que regula el pH de la superficie. Desde la década de 1960 la fosfatasa alcalina intestinal se ha utilizado en la administración de fármacos . Al escindir las subestructuras de fosfato de fármacos, agentes auxiliares e incluso de la superficie de nanoportadores, esta enzima permite el diseño de sistemas de administración de fármacos que pueden alterar sus propiedades en el cuerpo según sea necesario. [44] La solubilidad de muchos fármacos se puede mejorar sustancialmente mediante el diseño de profármacos de fosfato . En la mucosa intestinal , la fosfatasa alcalina elimina las subestructuras de fosfato y el fármaco se absorbe. [45] Además, los nanoportadores aniónicos que exhiben propiedades bioinertes pueden alterar su superficie para interactuar una vez que han alcanzado el epitelio intestinal debido a una fosfatasa alcalina que desencadena la escisión de los grupos fosfato aniónicos de su carga superficial que se convierte en catiónica, mejorando, por ejemplo, la absorción celular. [46]

En las células cancerosas

Los estudios muestran que la proteína fosfatasa alcalina que se encuentra en las células cancerosas es similar a la que se encuentra en los tejidos corporales no malignos y que la proteína se origina en el mismo gen en ambos. Un estudio comparó las enzimas de las metástasis hepáticas del carcinoma de pulmón de células gigantes y las células placentarias no malignas. Los dos eran similares en la secuencia del terminal NH2 , el mapa peptídico, el peso molecular de la subunidad y el punto isoelectrónico. [47]

En un estudio diferente en el que los científicos examinaron la presencia de la proteína fosfatasa alcalina en una línea celular de cáncer de colon humano, también conocida como HT-29, los resultados mostraron que la actividad enzimática era similar a la del tipo intestinal no maligno. Sin embargo, este estudio reveló que sin la influencia del butirato de sodio, la actividad de la fosfatasa alcalina es bastante baja en las células cancerosas. [48] ​​Un estudio basado en los efectos del butirato de sodio en las células cancerosas transmite que tiene un efecto sobre la expresión co-reguladora del receptor de andrógenos, la actividad de transcripción y también sobre la acetilación de histonas en las células cancerosas. [49] Esto explica por qué la adición de butirato de sodio muestra una mayor actividad de la fosfatasa alcalina en las células cancerosas del colon humano. [48] ​​Además, esto respalda aún más la teoría de que la actividad de la enzima fosfatasa alcalina en realidad está presente en las células cancerosas. [ cita necesaria ]

En otro estudio, se cultivaron células de coriocarcinoma en presencia de 5-bromo-2'-desoxiuridina y los resultados mostraron un aumento de 30 a 40 veces en la actividad de la fosfatasa alcalina. Este procedimiento de potenciar la actividad de la enzima se conoce como inducción enzimática . La evidencia muestra que, de hecho, existe actividad de la fosfatasa alcalina en las células tumorales, pero es mínima y es necesario mejorarla. Los resultados de este estudio indican además que las actividades de esta enzima varían entre las diferentes líneas celulares de coriocarcinoma y que la actividad de la proteína fosfatasa alcalina en estas células es menor que en las células de placenta no malignas. [50] [51] pero los niveles son significativamente más altos en niños y mujeres embarazadas. Los análisis de sangre siempre deben interpretarse utilizando el rango de referencia del laboratorio que realizó la prueba. Pueden producirse niveles elevados de fosfatasa alcalina si los conductos biliares están obstruidos. [52]

Además, el nivel de fosfatasa alcalina aumenta si se produce formación ósea activa, ya que la enzima es un subproducto de la actividad de los osteoblastos (como en el caso de la enfermedad ósea de Paget ). [ cita necesaria ]

El nivel de fosfatasa alcalina es mucho más elevado en las células de cáncer de próstata metastásico que en las células de cáncer de próstata no metastásico. [53] Los niveles altos de ALP en pacientes con cáncer de próstata se asocian con una disminución significativa en la supervivencia. [53]

Los niveles también están elevados en personas con enfermedad celíaca no tratada . [54] Los niveles reducidos del nivel de fosfatasa alcalina son menos comunes que los niveles elevados. La fuente de niveles elevados se puede deducir obteniendo los niveles séricos de γ-glutamiltransferasa . Los aumentos concomitantes de fosfatasa alcalina con γ-glutamiltransferasa deben hacer sospechar de enfermedad hepatobiliar. [55]

Algunas enfermedades no afectan los niveles de fosfatasa alcalina, por ejemplo, la hepatitis C. Un nivel alto de esta enzima no refleja ningún daño en el hígado, aunque los niveles altos de fosfatasa alcalina pueden deberse a un bloqueo del flujo en el tracto biliar o un aumento en la presión del hígado. [56]

Niveles elevados

A partir de 2020, los niveles normales de FA "no estaban bien definidos" y tiende a haber variaciones según el sexo y el origen racial, [57] y por edad, y los niños y adolescentes tienen niveles notablemente más altos. [58]

Hay muchas explicaciones posibles para la FA elevada. Cuando la causa no está clara, los estudios de isoenzimas mediante electroforesis pueden confirmar el origen del aumento. La eskelfosfatasa (que se localiza en los osteoblastos y las capas extracelulares de la matriz recién sintetizada) se libera a la circulación mediante un mecanismo aún no claro. [59] La fosfatasa alcalina placentaria está elevada en seminomas [60] y formas activas de raquitismo , así como en las siguientes enfermedades y afecciones: [61]

Niveles reducidos

Las siguientes condiciones o enfermedades pueden provocar niveles reducidos de fosfatasa alcalina: [65]

Usos pronósticos

Se demostró que la medición de la fosfatasa alcalina (junto con el antígeno prostático específico) durante y después de seis meses de cáncer de próstata metastásico tratado con hormonas predice la supervivencia de los pacientes. [67]

Fosfatasa alcalina leucocitaria

La fosfatasa alcalina leucocitaria se encuentra dentro de los glóbulos blancos maduros . Los niveles de LAP en glóbulos blancos pueden ayudar en el diagnóstico de ciertas afecciones. [ cita necesaria ]

Estructura y propiedades

La fosfatasa alcalina es una enzima homodimérica, lo que significa que está formada por dos moléculas. Los sitios catalíticos contienen tres iones metálicos, dos de Zn y uno de Mg, y ambos tipos son cruciales para que se produzca la actividad enzimática. Las enzimas catalizan la hidrólisis de monoésteres en ácido fosfórico, que además puede catalizar una reacción de transfosforilación con grandes concentraciones de aceptores de fosfato. Si bien las características principales del mecanismo catalítico y la actividad se conservan entre el fosfato alcalino de mamíferos y bacterianos, la fosfatasa alcalina de mamíferos tiene una actividad específica más alta y  valores de Km  , por lo tanto, una afinidad más baja, un pH más alcalino óptimo, una menor estabilidad al calor y, por lo general, están unidas a la membrana. y son inhibidos por l-aminoácidos y péptidos a través de un mecanismo no competitivo. Estas propiedades difieren notablemente entre diferentes isoenzimas de fosfatasa alcalina de mamíferos y, por lo tanto, muestran una diferencia en las funciones in vivo  . [ cita necesaria ]

La fosfatasa alcalina tiene homología con una gran cantidad de otras enzimas y forma parte de una superfamilia de enzimas con varios aspectos catalíticos y rasgos de sustrato superpuestos. Esto explica por qué las características estructurales más destacadas de los alcalinos de los mamíferos son la forma en que son y hacen referencia a su especificidad de sustrato y homología con otros miembros de la familia de isoenzimas nucleósido pirofosfatasa/fosfodiesterasa. [35] Las investigaciones han demostrado una relación entre los miembros de la familia de las fosfatasas alcalinas con las arilsulfatasas. Las similitudes en la estructura indican que estas dos familias de enzimas provienen de un ancestro común. Análisis adicionales han relacionado los fosfatos alcalinos y las arilsulfatasas con una superfamilia más grande. Algunos de los genes comunes que se encuentran en esta superfamilia son los que codifican fosfodiesterasas y autotoxinas. [69]

Ver también

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Otras lecturas

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