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Sec. de ARN

Resumen de RNA-Seq. Dentro del organismo, los genes se transcriben y (en un organismo eucariota ) se unen para producir transcripciones de ARNm maduros (rojo). El ARNm se extrae del organismo, se fragmenta y se copia en ADNc ds estable (azul). El ds-cDNA se secuencia utilizando métodos de secuenciación de lectura corta y alto rendimiento . Luego, estas secuencias se pueden alinear con una secuencia del genoma de referencia para reconstruir qué regiones del genoma se estaban transcribiendo. Estos datos se pueden utilizar para anotar dónde están los genes expresados, sus niveles de expresión relativos y cualquier variante de empalme alternativa. [1]

RNA-Seq (llamado así como una abreviatura de RNA sequencing ) es una técnica que utiliza secuenciación de próxima generación para revelar la presencia y cantidad de moléculas de ARN en una muestra biológica, proporcionando una instantánea de la expresión genética en la muestra, también conocida como transcriptoma . [2] [3]

Específicamente, RNA-Seq facilita la capacidad de observar transcripciones empalmadas de genes alternativos , modificaciones postranscripcionales , fusión de genes , mutaciones/ SNP y cambios en la expresión genética a lo largo del tiempo, o diferencias en la expresión genética en diferentes grupos o tratamientos. [4] Además de las transcripciones de ARNm, RNA-Seq puede analizar diferentes poblaciones de ARN para incluir ARN total, ARN pequeño, como miARN , ARNt y perfiles ribosómicos . [5] RNA-Seq también se puede utilizar para determinar los límites de exón / intrón y verificar o modificar los límites de los genes 5' y 3' previamente anotados . Los avances recientes en RNA-Seq incluyen secuenciación de células individuales , secuenciación de ARN en masa [6] , secuenciación in situ de tejido fijado y secuenciación de moléculas de ARN nativas con secuenciación en tiempo real de una sola molécula. [7] Otros ejemplos de aplicaciones emergentes de RNA-Seq debido al avance de los algoritmos bioinformáticos son la alteración del número de copias, la contaminación microbiana, los elementos transponibles, el tipo de célula (deconvolución) y la presencia de neoantígenos. [8]

Antes de RNA-Seq, los estudios de expresión génica se realizaban con microarrays basados ​​en hibridación . Los problemas con los microarrays incluyen artefactos de hibridación cruzada, mala cuantificación de genes de baja y alta expresión y la necesidad de conocer la secuencia a priori . [9] Debido a estos problemas técnicos, la transcriptómica pasó a métodos basados ​​en secuenciación. Estos progresaron desde la secuenciación de Sanger de bibliotecas de etiquetas de secuencia expresada hasta métodos basados ​​en etiquetas químicas (p. ej., análisis en serie de la expresión génica ) y, finalmente, hasta la tecnología actual, la secuenciación de próxima generación de ADN complementario (ADNc), en particular RNA-Seq.

Primero, el ARNm celular se extrae y se fragmenta en secuencias de ARNm más pequeñas, que se someten a transcripción inversa. Los ADNc resultantes se secuencian en una plataforma de secuenciación de próxima generación (NGS). Los resultados de dicha secuenciación permiten la generación de mapas genómicos de secuenciación transcriptómica.
Técnica experimental de secuenciación del transcriptoma (RNA-seq).

Métodos

Preparación de la biblioteca

Flujo de trabajo experimental típico de RNA-Seq. El ARN se aísla de múltiples muestras, se convierte en bibliotecas de ADNc, se secuencia en un formato legible por computadora, se alinea con una referencia y se cuantifica para análisis posteriores, como la expresión diferencial y el empalme alternativo. Descripción general de un flujo de trabajo experimental típico de RNA-Seq. [10]

Los pasos generales para preparar una biblioteca de ADN complementario (ADNc) para la secuenciación se describen a continuación, pero a menudo varían entre plataformas. [10] [3] [11]

  1. Aislamiento de ARN: el ARN se aísla del tejido y se mezcla con desoxirribonucleasa (DNasa). La ADNasa reduce la cantidad de ADN genómico. La cantidad de degradación del ARN se verifica con gel y electroforesis capilar y se utiliza para asignar un número de integridad del ARN a la muestra. Esta calidad del ARN y la cantidad total de ARN inicial se tienen en cuenta durante los pasos posteriores de preparación, secuenciación y análisis de la biblioteca.
  2. Selección/agotamiento de ARN: para analizar señales de interés, el ARN aislado puede mantenerse tal como está, enriquecerse con ARN con colas 3' poliadeniladas (poli(A)) para incluir solo ARNm eucariota , empobrecerse de ARN ribosomal (ARNr) y /o filtrado para ARN que se une a secuencias específicas ( tabla de métodos de selección y agotamiento de ARN , a continuación). Las moléculas de ARN que tienen colas 3' poli(A) en eucariotas se componen principalmente de secuencias codificantes maduras y procesadas. La selección de poli(A) se realiza mezclando ARN con oligómeros de poli(T) unidos covalentemente a un sustrato, normalmente perlas magnéticas. [12] [13] La selección de poli(A) tiene limitaciones importantes en la detección de biotipos de ARN. Muchos biotipos de ARN no están poliadenilados, incluidos muchos ARN no codificantes y transcripciones de proteínas con núcleo de histonas, o están regulados a través de la longitud de su cola poli(A) (p. ej., citoquinas) y, por lo tanto, es posible que no se detecten después de la selección poli(A). [14] Además, la selección poli(A) puede mostrar un mayor sesgo 3', especialmente con ARN de menor calidad. [15] [16] Estas limitaciones se pueden evitar con el agotamiento ribosómico, eliminando el ARNr que normalmente representa más del 90% del ARN de una célula. Tanto el enriquecimiento con poli(A) como el agotamiento ribosomal requieren mucha mano de obra y podrían introducir sesgos, por lo que se han desarrollado enfoques más simples para omitir estos pasos. [17] Los objetivos de ARN pequeños, como los miARN , se pueden aislar aún más mediante la selección de tamaño con geles de exclusión, perlas magnéticas o kits comerciales.
  3. Síntesis de ADNc: el ARN se transcribe de forma inversa a ADNc porque el ADN es más estable y para permitir la amplificación (que utiliza ADN polimerasas ) y aprovechar una tecnología de secuenciación de ADN más madura. La amplificación posterior a la transcripción inversa da como resultado la pérdida de cadena , que puede evitarse con marcaje químico o secuenciación de una sola molécula. La fragmentación y la selección de tamaño se realizan para purificar secuencias que tienen la longitud adecuada para la máquina secuenciadora. El ARN, el ADNc o ambos se fragmentan con enzimas, sonicación o nebulizadores. La fragmentación del ARN reduce el sesgo 5' de la transcripción inversa cebada aleatoriamente y la influencia de los sitios de unión del cebador , [13] con la desventaja de que los extremos 5' y 3' se convierten en ADN de manera menos eficiente. A la fragmentación le sigue la selección de tamaño, donde se eliminan secuencias pequeñas o se selecciona un rango reducido de longitudes de secuencia. Debido a que los ARN pequeños como los miARN se pierden, estos se analizan de forma independiente. El ADNc de cada experimento se puede indexar con un código de barras de hexámero u octámero, de modo que estos experimentos se puedan agrupar en un solo carril para la secuenciación multiplexada.

Secuenciación complementaria de ADN (cDNA-Seq)

Luego, la biblioteca de ADNc derivada de biotipos de ARN se secuencia en un formato legible por computadora. Existen muchas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento para la secuenciación de ADNc, incluidas plataformas desarrolladas por Illumina , Thermo Fisher , BGI/MGI , PacBio y Oxford Nanopore Technologies . [18] Para la secuenciación de lectura corta de Illumina, una tecnología común para la secuenciación de ADNc, se ligan adaptadores al ADNc, se une el ADN a una celda de flujo, se generan grupos a través de ciclos de amplificación y desnaturalización de puentes, y se secuencia por síntesis. realizado en ciclos de síntesis de hebras complementarias y excitación láser de bases con terminadores reversibles. La elección y los parámetros de la plataforma de secuenciación se guían por el diseño y el costo experimentales. Las consideraciones comunes del diseño experimental incluyen decidir sobre la longitud y la profundidad de la secuenciación, el uso de secuenciación de extremo único versus secuenciación de extremo emparejado, número de réplicas, multiplexación, aleatorización y picos. [19]

Secuenciación de ARN pequeño/ARN no codificante

Al secuenciar ARN distinto del ARNm, se modifica la preparación de la biblioteca. El ARN celular se selecciona en función del rango de tamaño deseado. Para dianas de ARN pequeñas, como miARN , el ARN se aísla mediante selección de tamaño. Esto se puede realizar con un gel de exclusión de tamaño, mediante perlas magnéticas de selección de tamaño o con un kit desarrollado comercialmente. Una vez aislados, se añaden conectores al extremo 3' y 5' y luego se purifican. El último paso es la generación de ADNc mediante transcripción inversa.

Secuenciación directa de ARN

Debido a que se ha demostrado que la conversión de ARN en ADNc , la ligadura, la amplificación y otras manipulaciones de muestras introducen sesgos y artefactos que pueden interferir tanto con la caracterización como con la cuantificación adecuadas de las transcripciones, [20] empresas como Helicos han explorado la secuenciación directa de ARN de una sola molécula. (en quiebra), Oxford Nanopore Technologies , [21] y otros. Esta tecnología secuencia moléculas de ARN directamente de manera masivamente paralela.

Secuenciación de ARN de una sola molécula en tiempo real

Se ha explorado el RNA-Seq directo de molécula única masivamente paralelo como una alternativa al RNA-Seq tradicional, en el que la conversión, ligación, amplificación y otros pasos de manipulación de muestras de ARN a ADNc pueden introducir sesgos y artefactos. [22] Las plataformas tecnológicas que realizan RNA-Seq en tiempo real de una sola molécula incluyen la secuenciación de nanoporos de Oxford Nanopore Technologies (ONT) , [21] PacBio IsoSeq y Helicos (en quiebra). La secuenciación del ARN en su forma nativa preserva modificaciones como la metilación, lo que permite investigarlas directa y simultáneamente. [21] Otro beneficio de RNA-Seq de una sola molécula es que las transcripciones se pueden cubrir en su totalidad, lo que permite una detección y cuantificación de isoformas de mayor confianza en comparación con la secuenciación de lectura corta. Tradicionalmente, los métodos RNA-Seq de una sola molécula tienen tasas de error más altas en comparación con la secuenciación de lectura corta, pero los métodos más nuevos como ONT direct RNA-Seq limitan los errores al evitar la fragmentación y la conversión de ADNc. Los usos recientes de ONT direct RNA-Seq para la expresión diferencial en poblaciones de células humanas han demostrado que esta tecnología puede superar muchas limitaciones de la secuenciación de ADNc corta y larga. [23]

Secuenciación de ARN unicelular (scRNA-Seq)

Los métodos estándar, como los microarrays y el análisis RNA-Seq en masa estándar, analizan la expresión de ARN de grandes poblaciones de células. En poblaciones de células mixtas, estas mediciones pueden ocultar diferencias críticas entre células individuales dentro de estas poblaciones. [24] [25]

La secuenciación de ARN unicelular (scRNA-Seq) proporciona los perfiles de expresión de células individuales. Aunque no es posible obtener información completa sobre cada ARN expresado por cada célula, debido a la pequeña cantidad de material disponible, se pueden identificar patrones de expresión genética mediante análisis de agrupación de genes . Esto puede descubrir la existencia de tipos de células raras dentro de una población de células que quizás nunca antes se hayan visto. Por ejemplo, en 2018, dos grupos identificaron células especializadas raras en el pulmón llamadas ionocitos pulmonares que expresan el regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística que realizaron scRNA-Seq en los epitelios de las vías respiratorias pulmonares. [26] [27]

Procedimientos experimentales

Flujo de trabajo típico de RNA-Seq unicelular. Se aíslan células individuales de una muestra en pocillos o gotitas, se generan y amplifican bibliotecas de ADNc, se secuencian bibliotecas y se generan matrices de expresión para análisis posteriores, como la identificación del tipo de célula.

Los protocolos actuales de scRNA-Seq implican los siguientes pasos: aislamiento de células individuales y ARN, transcripción inversa (RT), amplificación, generación de bibliotecas y secuenciación. Las células individuales se separan mecánicamente en micropocillos (p. ej., BD Rhapsody, Takara ICELL8, Vycap Puncher Platform o CellMicrosystems CellRaft) o se encapsulan en gotitas (p. ej., 10x Genomics Chromium, Illumina Bio-Rad ddSEQ, 1CellBio InDrop, Dolomite Bio Nadia). [28] Las células individuales se marcan añadiendo perlas con oligonucleótidos con código de barras; Tanto las células como las perlas se suministran en cantidades limitadas, de modo que la coocupación con múltiples células y perlas es un evento muy raro. Una vez que se completa la transcripción inversa, los ADNc de muchas células se pueden mezclar para secuenciarlos; Las transcripciones de una celda en particular se identifican mediante el código de barras único de cada celda. [29] [30] Se pueden adjuntar identificadores moleculares únicos (UMI) a secuencias objetivo de ARNm/ADNc para ayudar a identificar artefactos durante la preparación de la biblioteca. [31]

Los desafíos para scRNA-Seq incluyen preservar la abundancia relativa inicial de ARNm en una célula e identificar transcripciones raras. [32] El paso de transcripción inversa es fundamental ya que la eficiencia de la reacción de RT determina qué parte de la población de ARN de la célula será finalmente analizada por el secuenciador. La procesividad de las transcriptasas inversas y las estrategias de cebado utilizadas pueden afectar la producción de ADNc de longitud completa y la generación de bibliotecas sesgadas hacia el extremo 3' o 5' de los genes.

En el paso de amplificación, actualmente se utiliza PCR o transcripción in vitro (IVT) para amplificar el ADNc. Una de las ventajas de los métodos basados ​​en PCR es la capacidad de generar ADNc de longitud completa. Sin embargo, la diferente eficiencia de la PCR en secuencias particulares (por ejemplo, contenido de GC y estructura snapback) también puede amplificarse exponencialmente, produciendo bibliotecas con cobertura desigual. Por otro lado, si bien las bibliotecas generadas por IVT pueden evitar el sesgo de secuencia inducido por la PCR, secuencias específicas pueden transcribirse de manera ineficiente, lo que provoca la pérdida de secuencias o la generación de secuencias incompletas. [33] [24] Se han publicado varios protocolos scRNA-Seq: Tang et al., [34] STRT, [35] SMART-seq, [36] CEL-seq, [37] RAGE-seq, [38] Quartz -seq [39] y C1-CAGE. [40] Estos protocolos difieren en términos de estrategias para la transcripción inversa, síntesis y amplificación de ADNc, y la posibilidad de acomodar códigos de barras de secuencia específica (es decir, UMI ) o la capacidad de procesar muestras agrupadas. [41]

En 2017, se introdujeron dos enfoques para medir simultáneamente la expresión de proteínas y ARNm de una sola célula a través de anticuerpos marcados con oligonucleótidos conocidos como REAP-seq, [42] y CITE-seq. [43]

Aplicaciones

scRNA-Seq se está utilizando ampliamente en disciplinas biológicas que incluyen desarrollo, neurología , [44] oncología , [45] [46] [47] enfermedades autoinmunes , [48] y enfermedades infecciosas . [49]

scRNA-Seq ha proporcionado información considerable sobre el desarrollo de embriones y organismos, incluido el gusano Caenorhabditis elegans , [50] y la planaria regenerativa Schmidtea mediterranea . [51] [52] Los primeros animales vertebrados en ser mapeados de esta manera fueron el pez cebra [53] [54] y Xenopus laevis . [55] En cada caso se estudiaron múltiples etapas del embrión, lo que permitió mapear todo el proceso de desarrollo célula por célula. [10] La ciencia reconoció estos avances como el Avance del Año 2018 . [56]

Consideraciones experimentales

Se consideran una variedad de parámetros al diseñar y realizar experimentos de RNA-Seq:

Análisis

Un flujo de trabajo de análisis de RNA-Seq estándar. Las lecturas secuenciadas se alinean con un genoma y/o transcriptoma de referencia y posteriormente se procesan para una variedad de controles de calidad, descubrimientos y análisis basados ​​en hipótesis.

Montaje del transcriptoma

Se utilizan dos métodos para asignar lecturas de secuencias sin procesar a características genómicas (es decir, ensamblar el transcriptoma):

Alineación de RNA-Seq con lecturas cortas divididas en intrones. Alineación de lecturas cortas con una secuencia de ARNm y el genoma de referencia. El software de alineación debe tener en cuenta lecturas breves que se superponen a las uniones exón-exón (en rojo) y, por lo tanto, omiten secciones intrónicas del pre-ARNm y el genoma de referencia.

Una nota sobre la calidad del ensamblaje: el consenso actual es que 1) la calidad del ensamblaje puede variar según la métrica que se utilice, 2) las herramientas de ensamblaje que obtuvieron buenos resultados en una especie no necesariamente funcionan bien en la otra especie, y 3) combinar diferentes enfoques podría ser el más confiable. [77] [78] [79]

Cuantificación de la expresión genética.

La expresión se cuantifica para estudiar los cambios celulares en respuesta a estímulos externos, las diferencias entre estados sanos y enfermos y otras preguntas de investigación. Los niveles de transcripción se utilizan a menudo como un indicador de la abundancia de proteínas, pero a menudo no son equivalentes debido a eventos postranscripcionales como la interferencia del ARN y la descomposición mediada sin sentido . [80]

La expresión se cuantifica contando el número de lecturas asignadas a cada locus en el paso de ensamblaje del transcriptoma. La expresión se puede cuantificar para exones o genes utilizando contigs o anotaciones de transcripción de referencia. [10] Estos recuentos de lecturas de RNA-Seq observados se han validado sólidamente frente a tecnologías más antiguas, incluidas las micromatrices de expresión y qPCR . [57] [81] Las herramientas que cuantifican los recuentos son HTSeq, [82] FeatureCounts, [83] Rcount, [84] maxcounts, [85] FIXSEQ, [86] y Cuffquant. Estas herramientas determinan los recuentos de lectura a partir de datos de RNA-Seq alineados, pero también se pueden obtener recuentos sin alineación con Sailfish [87] y Kallisto. [88] Los recuentos de lecturas se convierten luego en métricas apropiadas para pruebas de hipótesis, regresiones y otros análisis. Los parámetros para esta conversión son:

Spike-ins para la cuantificación absoluta y la detección de efectos en todo el genoma

Los picos de ARN son muestras de ARN en concentraciones conocidas que pueden usarse como estándares de oro en el diseño experimental y durante los análisis posteriores para la cuantificación absoluta y la detección de efectos en todo el genoma.

expresión diferencial

El uso más simple pero a menudo más poderoso de RNA-Seq es encontrar diferencias en la expresión genética entre dos o más afecciones ( p . ej ., tratadas versus no tratadas); este proceso se llama expresión diferencial. Las salidas se denominan frecuentemente genes expresados ​​diferencialmente (DEG) y estos genes pueden estar regulados hacia arriba o hacia abajo ( es decir , más alto o más bajo en la condición de interés). Hay muchas herramientas que realizan expresión diferencial . La mayoría se ejecutan en R , Python o la línea de comandos de Unix . Las herramientas comúnmente utilizadas incluyen DESeq, [96] edgeR, [97] y voom+limma, [95] [102], todas las cuales están disponibles a través de R/ Bioconductor . [103] [104] Estas son las consideraciones comunes al realizar la expresión diferencial:

Los análisis posteriores para obtener una lista de genes expresados ​​diferencialmente son de dos tipos: validan observaciones y hacen inferencias biológicas. Debido a los inconvenientes de la expresión diferencial y RNA-Seq, las observaciones importantes se replican con (1) un método ortogonal en las mismas muestras (como la PCR en tiempo real ) o (2) otro experimento, a veces prerregistrado , en una nueva cohorte. . Esto último ayuda a garantizar la generalización y, por lo general, puede seguirse con un metanálisis de todas las cohortes agrupadas. El método más común para obtener una comprensión biológica de alto nivel de los resultados es el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes , aunque a veces se emplean enfoques de genes candidatos. El enriquecimiento del conjunto de genes determina si la superposición entre dos conjuntos de genes es estadísticamente significativa, en este caso la superposición entre genes expresados ​​diferencialmente y conjuntos de genes de vías/bases de datos conocidas (p. ej., ontología de genes , KEGG , ontología de fenotipo humano ) o de análisis complementarios en el mismos datos (como redes de coexpresión). Las herramientas comunes para el enriquecimiento de conjuntos de genes incluyen interfaces web ( p. ej. , ENRICHR, g:profiler, WEBGESTALT) [117] y paquetes de software. Al evaluar los resultados del enriquecimiento, una heurística es buscar primero el enriquecimiento de la biología conocida como control de cordura y luego ampliar el alcance para buscar biología novedosa.

Ejemplos de modos alternativos de empalme de ARN. Los exones se representan como bloques azules y amarillos, los intrones empalmados como líneas negras horizontales que conectan dos exones y las uniones exón-exón como delgadas líneas grises que conectan entre dos exones.

Splicing alternativo

El empalme de ARN es integral para los eucariotas y contribuye significativamente a la regulación y diversidad de proteínas, y ocurre en >90% de los genes humanos. [118] Existen múltiples modos de empalme alternativos : omisión de exones (modo de empalme más común en humanos y eucariotas superiores), exones mutuamente excluyentes, sitios donantes o aceptores alternativos, retención de intrones (modo de empalme más común en plantas, hongos y protozoos), sitio de inicio de transcripción alternativo (promotor) y poliadenilación alternativa. [118] Un objetivo de RNA-Seq es identificar eventos de empalme alternativos y probar si difieren entre condiciones. La secuenciación de lectura larga captura la transcripción completa y, por lo tanto, minimiza muchos de los problemas al estimar la abundancia de isoformas, como el mapeo de lectura ambiguo. Para RNA-Seq de lectura corta, existen múltiples métodos para detectar empalmes alternativos que se pueden clasificar en tres grupos principales: [119] [91] [120]

Las herramientas de expresión genética diferencial también se pueden utilizar para la expresión de isoformas diferenciales si las isoformas se cuantifican de antemano con otras herramientas como RSEM. [127]

Redes de coexpresión

Las redes de coexpresión son representaciones derivadas de datos de genes que se comportan de manera similar en tejidos y condiciones experimentales. [128] Su objetivo principal radica en la generación de hipótesis y los enfoques de culpa por asociación para inferir funciones de genes previamente desconocidos. [128] Los datos de RNA-Seq se han utilizado para inferir genes involucrados en vías específicas basadas en la correlación de Pearson , tanto en plantas [129] como en mamíferos. [130] La principal ventaja de los datos de RNA-Seq en este tipo de análisis sobre las plataformas de microarrays es la capacidad de cubrir todo el transcriptoma, lo que permite desentrañar representaciones más completas de las redes reguladoras de genes. La regulación diferencial de las isoformas de empalme del mismo gen se puede detectar y utilizar para predecir sus funciones biológicas. [131] [132] El análisis de redes de coexpresión de genes ponderados se ha utilizado con éxito para identificar módulos de coexpresión y genes centrales intramodulares basados ​​en datos de secuencias de ARN. Los módulos de coexpresión pueden corresponder a tipos o vías de células. Los hubs intramodulares altamente conectados pueden interpretarse como representantes de su módulo respectivo. Un gen propio es una suma ponderada de expresión de todos los genes en un módulo. Los genes propios son biomarcadores (características) útiles para el diagnóstico y el pronóstico. [133] Se han propuesto enfoques de transformación estabilizadora de la varianza para estimar coeficientes de correlación basados ​​en datos de secuencias de ARN. [129]

Descubrimiento de variantes

RNA-Seq captura la variación del ADN, incluidas variantes de un solo nucleótido y pequeñas inserciones/eliminaciones . y variación estructural . La llamada de variantes en RNA-Seq es similar a la llamada de variantes de ADN y, a menudo, emplea las mismas herramientas (incluidas SAMtools mpileup [134] y GATK HaplotypeCaller [135] ) con ajustes para tener en cuenta el empalme. Una dimensión única para las variantes de ARN es la expresión específica de alelo (ASE) : las variantes de un solo haplotipo podrían expresarse preferentemente debido a efectos reguladores que incluyen la impresión y la expresión de loci de rasgos cuantitativos y variantes raras no codificantes . [136] [137] Las limitaciones de la identificación de variantes de ARN incluyen que solo refleja regiones expresadas (en humanos, <5% del genoma), podría estar sujeta a sesgos introducidos por el procesamiento de datos (p. ej., los conjuntos de transcriptomas de novo subestiman la heterocigosidad [138 ] ), y tiene una calidad inferior en comparación con la secuenciación directa de ADN.

Edición de ARN (alteraciones postranscripcionales)

Tener las secuencias genómicas y transcriptómicas coincidentes de un individuo puede ayudar a detectar ediciones postranscripcionales ( edición de ARN ). [3] Se identifica un evento de modificación postranscripcional si la transcripción del gen tiene un alelo/variante no observado en los datos genómicos.

Un evento de fusión genética y el comportamiento de lecturas de extremos pares que caen a ambos lados de la unión genética. Las fusiones de genes pueden ocurrir en Trans , entre genes en cromosomas separados, o en Cis , entre dos genes en el mismo cromosoma.

Detección de genes de fusión

Provocados por diferentes modificaciones estructurales en el genoma, los genes de fusión han ganado atención por su relación con el cáncer. [139] La capacidad de RNA-Seq para analizar el transcriptoma completo de una muestra de manera imparcial lo convierte en una herramienta atractiva para encontrar este tipo de eventos comunes en el cáncer. [4]

La idea surge del proceso de alinear las lecturas transcriptómicas cortas con un genoma de referencia. La mayoría de las lecturas cortas se ubicarán dentro de un exón completo, y se esperaría que un conjunto más pequeño pero aún grande se mapee en uniones exón-exón conocidas. Las lecturas cortas restantes no asignadas se analizarían más a fondo para determinar si coinciden con una unión exón-exón donde los exones provienen de genes diferentes. Esto sería evidencia de un posible evento de fusión; sin embargo, debido a la longitud de las lecturas, esto podría resultar muy ruidoso. Un enfoque alternativo es utilizar lecturas de extremos emparejados, cuando una cantidad potencialmente grande de lecturas emparejadas asignaría cada extremo a un exón diferente, brindando una mejor cobertura de estos eventos (ver figura). No obstante, el resultado final consta de combinaciones de genes múltiples y potencialmente novedosas que proporcionan un punto de partida ideal para una mayor validación.

Alteración del número de copia

Los análisis de alteración del número de copias (CNA) se utilizan comúnmente en estudios de cáncer. La ganancia y la pérdida de genes tienen implicaciones en las vías de señalización y son un biomarcador clave de disfunción molecular en oncología. Obtener la información de CNA a partir de datos de RNA-Seq no es sencillo debido a las diferencias en la expresión genética, que conducen a una variación de la profundidad de lectura de diferentes magnitudes entre los genes. Debido a estas dificultades, la mayoría de estos análisis generalmente se realizan mediante secuenciación del genoma completo/secuenciación del exoma completo (WGS/WES). Pero las herramientas bioinformáticas avanzadas pueden llamar a CNA desde RNA-Seq. [140]

Otros análisis y aplicaciones emergentes

Las aplicaciones de RNA-Seq crecen día a día. Otra aplicación nueva de RNA-Seq incluye la detección de contaminantes microbianos, [141] determinar la abundancia del tipo de célula (deconvolución del tipo de célula), [8] medir la expresión de TE y la predicción de neoantígenos, etc. [8]

Historia

Las coincidencias de manuscritos publicados en Pubmed resaltan la creciente popularidad de RNA-Seq. Las coincidencias son para RNA-Seq (azul, términos de búsqueda: "RNA Seq" O "RNA-Seq" O "RNA sequencing" O "RNASeq") [ 142] y RNA=Seq en medicina (oro, términos de búsqueda: ("RNA Seq" O "RNA-Seq" O "Secuenciación de ARN" O "RNASeq") Y "Medicina"). [143] El número de manuscritos en PubMed que presentan RNA-Seq sigue aumentando.

RNA-Seq se desarrolló por primera vez a mediados de la década de 2000 con la llegada de la tecnología de secuenciación de próxima generación. [144] Los primeros manuscritos que utilizaron RNA-Seq incluso sin utilizar el término incluyen los de líneas celulares de cáncer de próstata [145] (con fecha de 2006), Medicago truncatula [146] (2006), maíz [147] (2007) y Arabidopsis. thaliana [148] (2007), mientras que el término "RNA-Seq" en sí se mencionó por primera vez en 2008. [13] [149] El número de manuscritos que hacen referencia a RNA-Seq en el título o resumen (Figura, línea azul) es aumentando continuamente con 6754 manuscritos publicados en 2018. La intersección de RNA-Seq y la medicina (Figura, línea dorada) tiene una celeridad similar. [150]

Aplicaciones a la medicina

RNA-Seq tiene el potencial de identificar la biología de nuevas enfermedades, perfilar biomarcadores para indicaciones clínicas, inferir vías farmacológicas y realizar diagnósticos genéticos. Estos resultados podrían personalizarse aún más para subgrupos o incluso pacientes individuales, lo que podría resaltar una prevención, diagnóstico y terapia más eficaces. La viabilidad de este enfoque depende en parte de los costos en dinero y tiempo; una limitación relacionada es el equipo necesario de especialistas (bioinformáticos, médicos/clínicos, investigadores básicos, técnicos) para interpretar completamente la enorme cantidad de datos generados por este análisis. [151]

Esfuerzos de secuenciación a gran escala.

Se ha dado mucho énfasis a los datos de RNA-Seq después de que los proyectos Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) y The Cancer Genome Atlas (TCGA) utilizaron este enfoque para caracterizar docenas de líneas celulares [152] y miles de muestras de tumores primarios. [153] respectivamente. ENCODE tenía como objetivo identificar regiones reguladoras de todo el genoma en diferentes cohortes de líneas celulares y los datos transcriptómicos son fundamentales para comprender el efecto posterior de esas capas reguladoras genéticas y epigenéticas. TCGA, en cambio, tenía como objetivo recopilar y analizar miles de muestras de pacientes de 30 tipos de tumores diferentes para comprender los mecanismos subyacentes de la transformación y progresión maligna. En este contexto, los datos de RNA-Seq proporcionan una instantánea única del estado transcriptómico de la enfermedad y analizan una población imparcial de transcripciones que permite la identificación de transcripciones nuevas, transcripciones de fusión y ARN no codificantes que podrían no detectarse con diferentes tecnologías.

Ver también

Referencias

Este artículo se envió a WikiJournal of Science para revisión por pares académicos externos en 2019 (informes de revisores). El contenido actualizado se reintegró a la página de Wikipedia bajo una licencia CC-BY-SA-3.0 ( 2021 ). La versión del registro revisada es: Felix Richter, et al. (17 de mayo de 2021). "Una amplia introducción a RNA-Seq" (PDF) . WikiRevista científica . 4 (2): 4. doi :10.15347/WJS/2021.004. ISSN  2470-6345. Wikidata  Q100146647.

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Otras lecturas

enlaces externos

Scholia tiene un perfil de tema para RNA-Seq .