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interferencia de ARN

Entrega lentiviral de shRNA diseñados y el mecanismo de interferencia del ARN en células de mamíferos.

La interferencia de ARN ( ARNi ) es un proceso biológico en el que las moléculas de ARN participan en la supresión específica de secuencia de la expresión génica mediante ARN bicatenario, mediante represión traduccional o transcripcional. Históricamente, el ARNi se conocía con otros nombres, como cosupresión , silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) y sofocación . El estudio detallado de cada uno de estos procesos aparentemente diferentes aclaró que la identidad de estos fenómenos era en realidad ARNi. Andrew Fire y Craig C. Mello compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 2006 por su trabajo sobre el ARNi en el gusano nematodo Caenorhabditis elegans , que publicaron en 1998. Desde el descubrimiento del ARNi y sus potenciales reguladores, se ha hecho evidente que el ARNi tiene un inmenso potencial en la supresión de genes deseados. Actualmente se sabe que el ARNi es preciso, eficiente, estable y mejor que la terapia antisentido para la supresión genética. [1] El ARN antisentido producido intracelularmente por un vector de expresión puede desarrollarse y encontrar utilidad como nuevos agentes terapéuticos. [2]

Dos tipos de pequeñas moléculas de ácido ribonucleico (ARN), el microARN (miARN) y el pequeño ARN de interferencia ( ARNip ), son fundamentales para los componentes de la vía del ARNi. Una vez que se degrada el ARNm, se produce un silenciamiento postranscripcional al impedirse la traducción de proteínas. La transcripción se puede inhibir mediante el mecanismo de silenciamiento pretranscripcional de ARNi, a través del cual un complejo enzimático cataliza la metilación del ADN en posiciones genómicas complementarias al ARNip o miARN complejados. El ARNi tiene un papel importante en la defensa de las células contra secuencias de nucleótidos parásitos (p. ej., virus o transposones ) y también influye en el desarrollo de los organismos.

La vía del ARNi es un proceso natural que se encuentra en muchos eucariotas y células animales. Es iniciado por la enzima Dicer , que escinde largas moléculas de ARN bicatenario (dsRNA) en fragmentos cortos bicatenarios de aproximadamente 21 a 23 nucleótidos de ARNip. Cada ARNip se desenrolla en dos ARN monocatenarios (ssRNA), la cadena pasajera (sentido) y la cadena guía (antisentido). Luego, la proteína Argonaute 2 (Ago2) escinde la cadena pasajera . La cadena pasajera se degrada y la cadena guía se incorpora al complejo silenciador inducido por ARN (RISC). Luego, el conjunto RISC se une y degrada el ARNm objetivo. Específicamente, esto se logra cuando la cadena guía se empareja con una secuencia complementaria en una molécula de ARNm e induce la escisión por Ago2, un componente catalítico del RISC. En algunos organismos, este proceso se propaga sistémicamente, a pesar de las concentraciones molares inicialmente limitadas de ARNip. [3]

El ARNi es una valiosa herramienta de investigación, tanto en cultivos celulares como en organismos vivos , porque el ARNbc sintético introducido en las células puede inducir de forma selectiva y sólida la supresión de genes de interés específicos. El ARNi se puede utilizar para exámenes a gran escala que desactivan sistemáticamente cada gen (y las proteínas subsiguientes que codifica) en la célula, lo que puede ayudar a identificar los componentes necesarios para un proceso celular particular o un evento como la división celular . La vía también se utiliza como herramienta práctica para alimentos, medicinas e insecticidas . [4]

Mecanismo celular

La proteína Dicer de Giardia intestinalis , que cataliza la escisión de dsRNA en siRNA. Los dominios RNasa están coloreados en verde, el dominio PAZ en amarillo, el dominio de plataforma en rojo y la hélice del conector en azul. [5]

RNAi es un proceso de silenciamiento de genes dependiente de ARN que está controlado por RISC y se inicia mediante moléculas cortas de ARN bicatenario en el citoplasma de una célula, donde interactúan con el componente catalítico de RISC Argonaute . [6] Cuando el ARNbc es exógeno (proviene de una infección por un virus con un genoma de ARN o de manipulaciones de laboratorio), el ARN se importa directamente al citoplasma y Dicer lo escinde en fragmentos cortos. El ARNbc iniciador también puede ser endógeno (originarse en la célula), como en los pre-microARN expresados ​​a partir de genes codificadores de ARN en el genoma. Las transcripciones primarias de dichos genes se procesan primero para formar la estructura de tallo-bucle característica del pre-miARN en el núcleo y luego se exportan al citoplasma. Por tanto, las dos vías del ARNbc, exógena y endógena, convergen en el RISC. [7]

El ARNds exógeno inicia la ARNi activando la proteína ribonucleasa Dicer, [8] que se une y escinde los ARNds en las plantas, o los ARN en forma de horquilla corta (shRNA) en los humanos, para producir fragmentos bicatenarios de 20 a 25 pares de bases con un saliente de 2 nucleótidos. en el extremo 3′. [9] Los estudios bioinformáticos sobre los genomas de múltiples organismos sugieren que esta longitud maximiza la especificidad del gen objetivo y minimiza los efectos no específicos. [10] Estos fragmentos cortos de doble cadena se denominan ARNip . Estos ARNip luego se separan en cadenas simples y se integran en un RISC activo mediante el complejo de carga RISC (RLC). RLC incluye Dicer-2 y R2D2, y es crucial para unir Ago2 y RISC. [11] El factor 11 asociado a la proteína de unión a TATA (TAF11) ensambla el RLC facilitando la tetramerización de Dcr-2-R2D2, lo que aumenta 10 veces la afinidad de unión al ARNip. La asociación con TAF11 convertiría el complejo R2-D2-Iniciador (RDI) en el RLC. [12] R2D2 lleva dominios de unión a ARN bicatenario en tándem para reconocer el extremo termodinámicamente estable de los dúplex de ARNip , mientras que Dicer-2 es el otro extremo menos estable. La carga es asimétrica: el dominio MID de Ago2 reconoce el extremo termodinámicamente estable del ARNip. Por lo tanto, la hebra "pasajera" (sentido) cuyo extremo 5' es descartado por MID es expulsada, mientras que la hebra "guía" guardada (antisentido) coopera con AGO para formar el RISC. [11]

Después de la integración en el RISC, los ARNip se emparejan con su ARNm objetivo y lo escinden, evitando así que se utilice como plantilla de traducción . [13] A diferencia del ARNip , un complejo RISC cargado de miARN escanea los ARNm citoplasmáticos en busca de posible complementariedad. En lugar de una escisión destructiva (por Ago2), los miARN se dirigen a las regiones 3' no traducidas (UTR) de los ARNm donde normalmente se unen con una complementariedad imperfecta, bloqueando así el acceso de los ribosomas para la traducción. [14]

El ARNbc exógeno se detecta y se une a una proteína efectora, conocida como RDE-4 en C. elegans y R2D2 en Drosophila , que estimula la actividad de Dicer. [15] Se desconoce el mecanismo que produce esta especificidad de longitud y esta proteína solo se une a ARNbc largos. [15]

En C. elegans, esta respuesta de iniciación se amplifica mediante la síntesis de una población de ARNip "secundarios" durante la cual los ARNip de iniciación o "primarios" producidos por Dicer se utilizan como plantillas. [16] Estos ARNip 'secundarios' son estructuralmente distintos de los ARNip producidos por Dicer y parecen ser producidos por una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP). [17] [18]

MicroARN

"La estructura secundaria de tallo-bucle de un premicroARN de Brassica oleracea ".

Los microARN (miARN) son ARN no codificantes codificados genómicamente que ayudan a regular la expresión genética , particularmente durante el desarrollo . [19] El fenómeno de la iARN, en sentido amplio, incluye los efectos de silenciamiento génico de los miARN inducidos endógenamente, así como el silenciamiento desencadenado por ARNds extraños. Los miARN maduros son estructuralmente similares a los ARNip producidos a partir de ARNbc exógeno, pero antes de alcanzar la madurez, los miARN deben someterse primero a una modificación postranscripcional extensa . Un miARN se expresa a partir de un gen codificador de ARN mucho más largo como una transcripción primaria conocida como pri-miARN que se procesa, en el núcleo celular , hasta una estructura de bucle madre de 70 nucleótidos llamada pre-miARN mediante el complejo de microprocesador . Este complejo consta de una enzima ARNasa III llamada Drosha y una proteína de unión a ARNbc DGCR8 . Dicer une y escinde la porción de ARNbc de este pre-miARN para producir la molécula de miARN madura que puede integrarse en el complejo RISC; por tanto, el miARN y el ARNip comparten la misma maquinaria celular posterior. [20] Primero, se describió el miARN codificado viral en el virus de Epstein-Barr (VEB). [21] A partir de entonces, se ha descrito un número cada vez mayor de microARN en virus. VIRmiRNA es un catálogo completo que cubre microARN viral, sus objetivos y miARN antivirales [22] (consulte también el recurso VIRmiRNA: http://crdd.osdd.net/servers/virmirna/).

Los ARNip derivados de precursores largos de ARNbc se diferencian de los miARN en que los miARN, especialmente los de animales, normalmente tienen un emparejamiento de bases incompleto con una diana e inhiben la traducción de muchos ARNm diferentes con secuencias similares. Por el contrario, los ARNip normalmente se emparejan perfectamente e inducen la escisión del ARNm solo en un objetivo único y específico. [23] En Drosophila y C. elegans , los miARN y siARN son procesados ​​por distintas proteínas Argonautas y enzimas Dicer. [24] [25]

Tres principales regiones no traducidas y microARN

Tres regiones principales no traducidas (3′UTR) de ARNm a menudo contienen secuencias reguladoras que causan ARNi postranscripcionalmente. Estas 3'-UTR suelen contener tanto sitios de unión para miARN como para proteínas reguladoras. Al unirse a sitios específicos dentro de la 3′-UTR, los miARN pueden disminuir la expresión génica de varios ARNm al inhibir la traducción o causar directamente la degradación de la transcripción. La 3′-UTR también puede tener regiones silenciadoras que se unen a proteínas represoras que inhiben la expresión de un ARNm.

La 3′-UTR a menudo contiene elementos de respuesta de microARN (MRE) . Los MRE son secuencias a las que se unen los miARN. Estos son motivos prevalentes dentro de las 3′-UTR. Entre todos los motivos reguladores dentro de las 3′-UTR (por ejemplo, incluidas las regiones silenciadoras), los MRE constituyen aproximadamente la mitad de los motivos.

En 2023, el sitio web miRBase , [26] un archivo de secuencias y anotaciones de miARN , enumeró 28.645 entradas en 271 especies biológicas. De estos, 1.917 miARN estaban en loci de miARN humanos anotados. Se predijo que los miARN tendrían un promedio de aproximadamente cuatrocientos ARNm diana (que afectan la expresión de varios cientos de genes). [27] Friedman et al. [27] estiman que >45.000 sitios objetivo de miARN dentro de las 3'UTR de ARNm humano se conservan por encima de los niveles de fondo, y >60% de los genes codificadores de proteínas humanas han estado bajo presión selectiva para mantener el emparejamiento con los miARN.

Los experimentos directos muestran que un solo miARN puede reducir la estabilidad de cientos de ARNm únicos. [28] Otros experimentos muestran que un solo miARN puede reprimir la producción de cientos de proteínas, pero que esta represión a menudo es relativamente leve (menos de 2 veces). [29] [30]

Los efectos de la desregulación de la expresión genética de los miARN parecen ser importantes en el cáncer. [31] Por ejemplo, en los cánceres gastrointestinales, se han identificado nueve miARN como alterados epigenéticamente y eficaces para regular a la baja las enzimas reparadoras del ADN. [32]

Los efectos de la desregulación de la expresión genética de los miARN también parecen ser importantes en los trastornos neuropsiquiátricos, como la esquizofrenia, el trastorno bipolar, la depresión mayor, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y los trastornos del espectro autista. [33] [34] [35]

Activación y catálisis de RISC.

El ARNbc exógeno se detecta y se une a una proteína efectora, conocida como RDE-4 en C. elegans y R2D2 en Drosophila , que estimula la actividad de Dicer. [15] Esta proteína solo se une a ARNbc largos, pero se desconoce el mecanismo que produce esta especificidad de longitud. [15] Esta proteína de unión a ARN facilita la transferencia de ARNip escindidos al complejo RISC. [36]

En C. elegans, esta respuesta de iniciación se amplifica mediante la síntesis de una población de ARNip "secundarios" durante la cual los ARNip de iniciación o "primarios" producidos por Dicer se utilizan como plantillas. [16] Estos ARNip 'secundarios' son estructuralmente distintos de los ARNip producidos por Dicer y parecen ser producidos por una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP). [17] [18]

Biogénesis de ARN pequeño : los miARN primarios (pri-miARN) se transcriben en el núcleo y se pliegan sobre sí mismos como horquillas que luego se recortan en el núcleo mediante un complejo de microprocesador para formar un pre-ARN en horquilla de ~ 60-70 nt. Este pre-miARN se transporta a través del complejo de poro nuclear (NPC) hacia el citoplasma, donde Dicer lo recorta aún más hasta obtener un dúplex de miARN de aproximadamente 20 nt (los pre-siARN también ingresan a la vía en este paso). Luego, este dúplex se carga en Ago para formar el "pre-RISC (complejo silenciador inducido por ARN)" y la cadena pasajera se libera para formar RISC activo . [ se necesita referencia de imagen ]
Izquierda: Una proteína Argonauta de longitud completa de la especie de arquea Pyrococcus furiosus . Derecha: el dominio PIWI de una proteína Argonauta en complejo con ARN bicatenario .

Los componentes activos de un complejo silenciador inducido por ARN (RISC) son endonucleasas llamadas proteínas Argonautas, que escinden la cadena de ARNm objetivo complementaria a su ARNip unido . [6] Como los fragmentos producidos por Dicer son de doble cadena, en teoría cada uno de ellos podría producir un ARNip funcional . Sin embargo, sólo una de las dos hebras, que se conoce como hebra guía , se une a Argonaute y dirige el silenciamiento del gen. El otro hilo antiguía o hilo pasajero se degrada durante la activación de RISC. [37] Aunque al principio se creyó que una helicasa dependiente de ATP separaba estas dos hebras, [38] el proceso demostró ser independiente de ATP y realizado directamente por los componentes proteicos de RISC. [3] [39] Sin embargo, un análisis cinético in vitro de ARNi en presencia y ausencia de ATP mostró que es posible que se requiera ATP para desenrollar y eliminar la cadena de ARNm escindida del complejo RISC después de la catálisis. [40] La cadena guía tiende a ser aquella cuyo extremo 5' está emparejado de manera menos estable con su complemento, [41] pero la selección de la cadena no se ve afectada por la dirección en la que Dicer escinde el dsRNA antes de la incorporación de RISC. [42] En cambio, la proteína R2D2 puede servir como factor diferenciador al unirse al extremo 5' más estable de la cadena pasajera. [43]

La base estructural para la unión del ARN a la proteína Argonaute se examinó mediante cristalografía de rayos X del dominio de unión de un Argonaute unido al ARN. Aquí, el extremo 5' fosforilado de la cadena de ARN entra en una bolsa de superficie básica conservada y hace contactos a través de un catión divalente (un átomo con dos cargas positivas) como el magnesio y mediante apilamiento aromático (un proceso que permite que más de un átomo comparta un electrón haciéndolo pasar de un lado a otro) entre el nucleótido 5' del ARNip y un residuo de tirosina conservado . Se cree que este sitio forma un sitio de nucleación para la unión del ARNip a su objetivo de ARNm. [44] El análisis del efecto inhibidor de los desajustes en el extremo 5' o 3' de la cadena guía ha demostrado que el extremo 5' de la cadena guía es probablemente responsable de hacer coincidir y unir el ARNm objetivo, mientras que el extremo 3' es responsable de organizar físicamente el ARNm objetivo en una región RISC favorable a la escisión. [40]

No se comprende cómo el complejo RISC activado localiza los ARNm complementarios dentro de la célula. Aunque se ha propuesto que el proceso de escisión está vinculado a la traducción , la traducción del objetivo del ARNm no es esencial para la degradación mediada por ARNi. [45] De hecho, el ARNi puede ser más eficaz contra objetivos de ARNm que no están traducidos. [46] Las proteínas argonauta se localizan en regiones específicas del citoplasma llamadas cuerpos P (también cuerpos citoplasmáticos o cuerpos GW), que son regiones con altas tasas de descomposición del ARNm; [47] La ​​actividad de miARN también se agrupa en cuerpos P. [48] ​​La alteración de los cuerpos P disminuye la eficiencia del ARNi, lo que sugiere que son un sitio crítico en el proceso del ARNi. [49]

Silenciamiento transcripcional

La enzima Dicer recorta el ARN bicatenario para formar pequeños ARN de interferencia o microARN . Estos ARN procesados ​​se incorporan al complejo silenciador inducido por ARN (RISC), que se dirige al ARN mensajero para evitar la traducción . [50]

Los componentes de la vía del ARNi se utilizan en muchos eucariotas para el mantenimiento de la organización y estructura de sus genomas . La modificación de las histonas y la inducción asociada de la formación de heterocromatina sirven para regular negativamente los genes pretranscripcionalmente ; [51] este proceso se conoce como silenciamiento transcripcional inducido por ARN (RITS) y lo lleva a cabo un complejo de proteínas llamado complejo RITS. En la levadura de fisión, este complejo contiene Argonauta, una proteína de cromodominio Chp1 y una proteína llamada Tas3 de función desconocida. [52] Como consecuencia, la inducción y propagación de regiones heterocromáticas requiere las proteínas Argonaute y RdRP. [53] De hecho, la eliminación de estos genes en la levadura de fisión S. pombe altera la metilación de las histonas y la formación del centrómero , [54] provocando una anafase lenta o estancada durante la división celular . [55] En algunos casos, se ha observado que procesos similares asociados con la modificación de histonas regulan positivamente la transcripción de genes. [56]

El mecanismo por el cual el complejo RITS induce la formación y organización de heterocromatina no se comprende bien. La mayoría de los estudios se han centrado en la región de tipo de apareamiento en la levadura de fisión, que puede no ser representativa de las actividades en otras regiones/organismos genómicos. En el mantenimiento de las regiones de heterocromatina existentes, RITS forma un complejo con ARNip complementarios a los genes locales y se une de manera estable a histonas metiladas locales, actuando cotranscripcionalmente para degradar cualquier transcripción de pre-ARNm naciente que sea iniciada por la ARN polimerasa . La formación de dicha región de heterocromatina, aunque no su mantenimiento, depende de Dicer, presumiblemente porque se requiere que Dicer genere el complemento inicial de ARNip que se dirigen a transcripciones posteriores. [57] Se ha sugerido que el mantenimiento de la heterocromatina funciona como un circuito de retroalimentación que se refuerza a sí mismo, ya que RdRP forma nuevos ARNip a partir de transcripciones nacientes ocasionales para su incorporación a complejos RITS locales. [58] La relevancia de las observaciones de las regiones de tipo de apareamiento de levaduras de fisión y centrómeros para los mamíferos no está clara, ya que el mantenimiento de la heterocromatina en células de mamíferos puede ser independiente de los componentes de la vía del ARNi. [59]

Diafonía con edición de ARN

El tipo de edición de ARN que prevalece en eucariotas superiores convierte los nucleótidos de adenosina en inosina en ARNbc a través de la enzima adenosina desaminasa (ADAR). [60] Originalmente se propuso en 2000 que las vías de edición de ARNi y ARN A→I podrían competir por un sustrato de ARNbc común. [61] Algunos pre-miARN se someten a edición de ARN A → I [62] [63] y este mecanismo puede regular el procesamiento y la expresión de miARN maduros. [63] Además, al menos un ADAR de mamífero puede secuestrar ARNip de los componentes de la vía de ARNi. [64] Un mayor apoyo para este modelo proviene de estudios sobre cepas de C. elegans nulas para ADAR que indican que la edición de ARN A → I puede contrarrestar el silenciamiento de ARNi de genes y transgenes endógenos. [sesenta y cinco]

Ilustración de las principales diferencias entre el silenciamiento de genes de plantas y animales. Dicer procesa el microARN expresado de forma nativa o el pequeño ARN de interferencia exógeno y lo integra en el complejo RISC , que media el silenciamiento de genes. [66]

Variación entre organismos.

Los organismos varían en su capacidad para captar ARNbc extraño y utilizarlo en la vía del ARNi. Los efectos del ARNi pueden ser tanto sistémicos como hereditarios en plantas y C. elegans , aunque no en Drosophila ni en mamíferos. En las plantas, se cree que el ARNi se propaga mediante la transferencia de ARNip entre células a través de plasmodesmos (canales en las paredes celulares que permiten la comunicación y el transporte). [38] La heredabilidad proviene de la metilación de los promotores a los que se dirige el ARNi; el nuevo patrón de metilación se copia en cada nueva generación de células. [67] Una amplia distinción general entre plantas y animales radica en la orientación de los miARN producidos endógenamente; en las plantas, los miARN suelen ser perfecta o casi perfectamente complementarios con sus genes diana e inducen la escisión directa del ARNm mediante RISC, mientras que los miARN de los animales tienden a tener una secuencia más divergente e inducen represión traduccional. [66] Este efecto traduccional puede producirse inhibiendo las interacciones de los factores de iniciación de la traducción con la cola de poliadenina del ARNm . [68]

Algunos protozoos eucariotas como Leishmania major y Trypanosoma cruzi carecen por completo de la vía del ARNi. [69] [70] La mayoría o todos los componentes también faltan en algunos hongos , sobre todo en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae . [71] La presencia de ARNi en otras especies de levadura en ciernes, como Saccharomyces castellii y Candida albicans , demuestra además que la inducción de dos proteínas relacionadas con ARNi de S. castellii facilita la ARNi en S. cerevisiae . [72] El hecho de que a ciertos ascomicetos y basidiomicetos les falten vías de ARNi indica que las proteínas necesarias para el silenciamiento de ARN se han perdido independientemente de muchos linajes de hongos , posiblemente debido a la evolución de una nueva vía con función similar, o a la falta de ventaja selectiva en ciertos nichos . [73]

Sistemas procarióticos relacionados

La expresión genética en procariotas está influenciada por un sistema basado en ARN similar en algunos aspectos al ARNi. Aquí, los genes que codifican el ARN controlan la abundancia o la traducción del ARNm al producir un ARN complementario que se hibrida con un ARNm. Sin embargo, generalmente no se considera que estos ARN reguladores sean análogos a los miARN porque la enzima Dicer no está involucrada. [74] Se ha sugerido que los sistemas de interferencia CRISPR en procariotas son análogos a los sistemas de ARNi eucariotas, aunque ninguno de los componentes proteicos es ortólogo . [75]

Funciones biológicas

Inmunidad

El ARNi es una parte vital de la respuesta inmune a virus y otro material genético extraño , especialmente en plantas donde también puede prevenir la autopropagación de transposones. [76] Plantas como Arabidopsis thaliana expresan múltiples homólogos de Dicer que están especializados para reaccionar de manera diferente cuando la planta está expuesta a diferentes virus. [77] Incluso antes de que se comprendiera completamente la vía del ARNi, se sabía que el silenciamiento genético inducido en las plantas podría extenderse por toda la planta en un efecto sistémico y podría transferirse de las plantas madre a las plantas vástago mediante injertos . [78] Desde entonces, este fenómeno ha sido reconocido como una característica del sistema inmunológico de la planta que permite que toda la planta responda a un virus después de un encuentro inicial localizado. [79] En respuesta, muchos virus de plantas han desarrollado mecanismos elaborados para suprimir la respuesta de ARNi. [80] Estos incluyen proteínas virales que se unen a fragmentos cortos de ARN bicatenario con extremos salientes monocatenarios, como los producidos por Dicer. [81] Algunos genomas de plantas también expresan ARNip endógenos en respuesta a la infección por tipos específicos de bacterias . [82] Estos efectos pueden ser parte de una respuesta generalizada a los patógenos que regula negativamente cualquier proceso metabólico en el huésped que ayude al proceso de infección. [83]

Aunque los animales generalmente expresan menos variantes de la enzima Dicer que las plantas, el ARNi en algunos animales produce una respuesta antiviral. Tanto en Drosophila juvenil como adulta , el ARNi es importante en la inmunidad antiviral innata y es activo contra patógenos como el virus Drosophila X. [84] [85] Un papel similar en la inmunidad puede operar en C. elegans , ya que las proteínas Argonaute están reguladas positivamente en respuesta a virus y gusanos que sobreexpresan componentes de la vía de ARNi que son resistentes a la infección viral. [86] [87]

El papel del ARNi en la inmunidad innata de los mamíferos no se conoce bien y hay relativamente pocos datos disponibles. Sin embargo, la existencia de virus que codifican genes capaces de suprimir la respuesta de ARNi en células de mamíferos puede ser evidencia a favor de una respuesta inmune de mamíferos dependiente de ARNi, [88] [89] aunque esta hipótesis ha sido cuestionada por estar poco fundamentada. [90] Se han presentado pruebas de la existencia de una vía de ARNi antiviral funcional en células de mamíferos. [91] [92]

También existen otras funciones del ARNi en virus de mamíferos, como los miARN expresados ​​por el virus del herpes que pueden actuar como desencadenantes de la organización de la heterocromatina para mediar la latencia viral. [93]

Regulación negativa de genes

Los miARN expresados ​​endógenamente, incluidos los miARN intrónicos e intergénicos , son más importantes en la represión traduccional [66] y en la regulación del desarrollo, especialmente en el momento de la morfogénesis y el mantenimiento de tipos de células indiferenciadas o incompletamente diferenciadas, como las células madre . [94] El papel del miARN expresado endógenamente en la regulación negativa de la expresión génica se describió por primera vez en C. elegans en 1993. [95] En las plantas, esta función se descubrió cuando se demostró que el "microARN JAW" de Arabidopsis estaba involucrado en la regulación de varios Genes que controlan la forma de las plantas. [96] En las plantas, la mayoría de los genes regulados por miARN son factores de transcripción ; [97] por lo tanto, la actividad de los miARN es particularmente amplia y regula redes genéticas completas durante el desarrollo mediante la modulación de la expresión de genes reguladores clave, incluidos factores de transcripción y proteínas F-box . [98] En muchos organismos, incluidos los humanos, los miARN están relacionados con la formación de tumores y la desregulación del ciclo celular . Aquí, los miARN pueden funcionar como oncogenes y supresores de tumores . [99]

Evolución

Según el análisis filogenético basado en la parsimonia , el ancestro común más reciente de todos los eucariotas probablemente ya poseía una vía temprana de ARNi; Se cree que la ausencia de la vía en ciertos eucariotas es una característica derivada. [100] Este sistema ancestral de ARNi probablemente contenía al menos una proteína similar a Dicer, un Argonauta, una proteína PIWI y una ARN polimerasa dependiente de ARN que también puede haber desempeñado otras funciones celulares. Un estudio genómico comparativo a gran escala también indica que el grupo de la corona eucariota ya poseía estos componentes, que luego podrían haber tenido asociaciones funcionales más estrechas con sistemas de degradación generalizada del ARN, como el exosoma . [101] Este estudio también sugiere que la familia de proteínas Argonaute de unión a ARN, que se comparte entre eucariotas, la mayoría de las arqueas y al menos algunas bacterias (como Aquifex aeolicus ), es homóloga y originalmente evolucionó a partir de componentes del sistema de iniciación de la traducción. .

Aplicaciones

Vía de ARNi para la eliminación de genes

La eliminación de genes es un método utilizado para reducir la expresión de genes específicos de un organismo. Esto se logra utilizando el proceso natural de ARNi. [6] Esta técnica de eliminación de genes utiliza una molécula de ARNip bicatenario que se sintetiza con una secuencia complementaria al gen de interés. La cascada de ARNi comienza una vez que la enzima Dicer comienza a procesar ARNip. El resultado final del proceso conduce a la degradación del ARNm y destruye las instrucciones necesarias para construir ciertas proteínas. Con este método, los investigadores pueden disminuir (pero no eliminar por completo) la expresión de un gen objetivo. El estudio de los efectos de esta disminución en la expresión puede mostrar el papel fisiológico o el impacto de los productos genéticos objetivo. [102] [103]

Efectos fuera del objetivo de la destrucción de genes

Se han dirigido grandes esfuerzos en biología computacional hacia el diseño de reactivos de ARNbc exitosos que maximicen la eliminación de genes pero minimicen los efectos "fuera del objetivo". Los efectos fuera del objetivo surgen cuando un ARN introducido tiene una secuencia de bases que puede emparejarse y, por lo tanto, reducir la expresión de múltiples genes. Estos problemas ocurren con mayor frecuencia cuando el ARNbc contiene secuencias repetitivas. A partir del estudio de los genomas de humanos, C. elegans y S. pombe , se ha estimado que alrededor del 10% de los posibles ARNip tienen efectos sustanciales fuera del objetivo. [10] Se han desarrollado multitud de herramientas de software que implementan algoritmos para el diseño de ARNip generales [104] [105] específicos de mamíferos, [106] y específicos de virus [107] que se verifican automáticamente para detectar una posible reactividad cruzada.

Dependiendo del organismo y del sistema experimental, el ARN exógeno puede ser una cadena larga diseñada para ser escindida por Dicer, o ARN cortos diseñados para servir como sustratos de ARNip . En la mayoría de las células de mamíferos, se utilizan ARN más cortos porque las largas moléculas de ARN de doble cadena inducen la respuesta al interferón de los mamíferos , una forma de inmunidad innata que reacciona de forma no específica al material genético extraño. [108] Los ovocitos de ratón y las células de embriones tempranos de ratón carecen de esta reacción al ARNbc exógeno y, por lo tanto, son un sistema modelo común para estudiar los efectos de la destrucción de genes en mamíferos. [109] También se han desarrollado técnicas de laboratorio especializadas para mejorar la utilidad del ARNi en sistemas de mamíferos evitando la introducción directa de ARNip , por ejemplo, mediante transfección estable con un plásmido que codifica la secuencia apropiada a partir de la cual se pueden transcribir los ARNip , [110] o por sistemas de vectores lentivirales más elaborados que permiten la activación o desactivación inducible de la transcripción, conocido como ARNi condicional . [111] [112]

Medicamentos

Una mosca Drosophila adulta normal , un organismo modelo común utilizado en experimentos de ARNi.
Cronología del uso de ARNi en medicina entre 1996 y 2017

La técnica de derribar genes mediante terapias de ARNi ha demostrado su éxito en estudios clínicos controlados aleatorios. Estos medicamentos son una clase cada vez mayor de fármacos basados ​​en ARNip que disminuyen la expresión de proteínas codificadas por ciertos genes. Hasta la fecha, las autoridades reguladoras de EE. UU. y Europa han aprobado cinco medicamentos de ARNi: patisiran (2018), givosiran (2019), lumasiran (2020), inclisiran (2020 en Europa con aprobación prevista en EE. UU. en 2021) y vutrisiran (2022). ). [113] [114] [115] [116]

Si bien todas las terapias de ARNi aprobadas por el organismo regulador actual se centran en enfermedades que se originan en el hígado, los medicamentos adicionales que se están investigando se dirigen a una serie de áreas de enfermedades que incluyen enfermedades cardiovasculares, trastornos hemorrágicos, trastornos por consumo de alcohol, fibrosis quística, gota, carcinoma y trastornos oculares. .

Patisiran es el primer medicamento basado en ARNip bicatenario aprobado en 2018 y desarrollado por Alnylam Pharmaceuticals . Patisiran utiliza la cascada de ARNi para suprimir el gen que codifica TTR (transtrietina). Las mutaciones en este gen pueden provocar el plegamiento incorrecto de una proteína responsable de la amiloidosis ATTR hereditaria . Para lograr una respuesta terapéutica, patrisan está recubierto por una membrana de nanopartículas lipídicas que facilita el cruce hacia el citoplasma. Una vez dentro de la célula, el ARNip comienza a ser procesado por la enzima Dicer. Patirisan es administrado por un profesional sanitario mediante una perfusión intravenosa con dosificación basada en el peso corporal. Las advertencias y precauciones incluyen el riesgo de reacciones relacionadas con la infusión y niveles reducidos de vitamina A (suero). [117]

En 2019, la FDA y la EMA aprobaron givosiran para el tratamiento de adultos con porfiria hepática aguda (AHP). [118] La FDA también otorgó a givosiran una designación de terapia innovadora , una designación de revisión prioritaria y una designación de medicamento huérfano para el tratamiento de la porfiria hepática aguda (AHP) en noviembre de 2019. [119] Para 2020, givosiran recibió la aprobación de la EMA. [120] Givosiran es un ARNip que descompone el ARNm de la ácido aminolevulínico sintasa 1 (ALAS1) en el hígado. La descomposición del ARNm de ALAS1 evita que se acumulen toxinas (responsables de los ataques neuroviscerales y la enfermedad AHP) como el ácido aminolevulínico (ALA) y el porfobilinógeno (PBG). [121] [122] [123] [124] Para facilitar la entrada al citoplasma, givosiran utiliza ligandos GalNAc y ingresa a las células del hígado. El medicamento lo administra un profesional de la salud por vía subcutánea y la dosificación se basa en el peso corporal. Las advertencias y precauciones incluyen riesgo de reacciones anafilácticas, toxicidad hepática, toxicidad renal y reacciones en el lugar de la inyección. [125]

Lumasiran fue aprobado como medicamento a base de ARNip en 2020 para su uso tanto en la Unión Europea como en los Estados Unidos. [126] [127] Este medicamento se usa para el tratamiento de la hiperoxaluria primaria tipo 1 (PH1) en poblaciones pediátricas y adultas. El fármaco está diseñado para reducir la producción de oxalato hepático y los niveles de oxalato urinario a través de ARNi dirigiéndose al ARNm de la hidroxiácido oxidasa 1 (HAO1) ​​para su descomposición. La reducción de los niveles de la enzima HAO1 reduce la oxidación del glicolato a glioxilato (que es un sustrato del oxalato). Lumasiran lo administra por vía subcutánea un profesional sanitario con una dosificación basada en el peso corporal. [128] Los datos de ensayos clínicos controlados aleatorios indican que la reacción adversa más común que se informó fueron reacciones en el lugar de la inyección. Estas reacciones fueron leves y estuvieron presentes en el 38 por ciento de los pacientes tratados con lumasiran. [129]

En 2022, la FDA y la EMA aprobaron vutrisiran para el tratamiento de adultos con amiloidosis hereditaria mediada por transtiretina con polineuropatía en etapa 1 o 2. [130] [131] Vutrisiran está diseñado para descomponer el ARNm que codifica la transtiretina .

Otros medicamentos en investigación que utilizan ARNi están siendo desarrollados por compañías farmacéuticas como Arrowhead Pharmaceuticals , Dicerna, Alnylam Pharmaceuticals , Amgen y Sylentis. Estos medicamentos cubren una variedad de objetivos a través de ARNi y enfermedades.

Terapéuticas de ARNi en investigación en desarrollo:

Categorización jurídica y cuestiones jurídicas en un futuro próximo.

Actualmente, tanto el miRNA como el SiRNA se sintetizan químicamente y, por lo tanto, están clasificados legalmente dentro de la UE y en EE. UU. como productos medicinales "simples". Pero como se están desarrollando ARNip de bioingeniería (BERA), estos se clasificarían como productos medicinales biológicos, al menos en la UE. El desarrollo de la tecnología BERA plantea la cuestión de la categorización de fármacos que tienen el mismo mecanismo de acción pero se producen química o biológicamente. Esta falta de coherencia debe abordarse. [132]

Mecanismos de entrega

Para lograr el potencial clínico del ARNi, el ARNip debe transportarse de manera eficiente a las células de los tejidos diana. Sin embargo, existen varias barreras que deben superarse antes de que pueda utilizarse clínicamente. Por ejemplo, el ARNip "desnudo" es susceptible a varios obstáculos que reducen su eficacia terapéutica. [133] Además, una vez que el ARNip ha ingresado al torrente sanguíneo, el ARN desnudo puede ser degradado por las nucleasas séricas y puede estimular el sistema inmunológico innato. [133] Debido a su tamaño y naturaleza altamente polianiónica (que contiene cargas negativas en varios sitios), las moléculas de ARNip no modificadas no pueden ingresar fácilmente a las células a través de la membrana celular. Por lo tanto, se debe utilizar ARNip artificial o encapsulado en nanopartículas . Si el ARNip se transfiere a través de la membrana celular, pueden ocurrir toxicidades no deseadas si no se optimizan las dosis terapéuticas, y los ARNip pueden exhibir efectos no deseados (por ejemplo, regulación negativa no deseada de genes con complementariedad de secuencia parcial ). [134] Incluso después de ingresar a las células, se requieren dosis repetidas ya que sus efectos se diluyen en cada división celular. En respuesta a estos posibles problemas y barreras, dos enfoques ayudan a facilitar la entrega de ARNip a las células diana: nanopartículas lipídicas y conjugados. [135]

Nanopartículas lipídicas

Las nanopartículas lipídicas (LNP) se basan en estructuras similares a liposomas que generalmente están formadas por un centro acuoso rodeado por una capa lipídica. [136] Un subconjunto de estructuras liposomales utilizadas para administrar fármacos a los tejidos descansa en grandes vesículas unilaminares (LUV) que pueden tener un tamaño de 100 nm. Los mecanismos de administración de LNP se han convertido en una fuente cada vez mayor de ácidos nucleicos envolventes y pueden incluir plásmidos , CRISPR y ARNm . [137]

El primer uso aprobado de nanopartículas lipídicas como mecanismo de administración de fármacos comenzó en 2018 con el fármaco patisiran de ARNip, desarrollado por Alnylam Pharmaceuticals. Dicerna Pharmaceuticals, Persomics , Sanofi y Sirna Therapeutics también trabajaron para llevar las terapias de ARNi al mercado. [138] [139]

Otras aplicaciones recientes incluyen dos vacunas COVID-19 aprobadas por la FDA: mRNA-1273, desarrollada por Moderna . y BNT162b , desarrollado mediante una colaboración entre Pfizer y BioNtech . [140] Estas dos vacunas utilizan nanopartículas lipídicas para administrar ARNm de antígeno. Encapsular la molécula de ARNm en nanopartículas lipídicas fue un avance crítico para producir vacunas de ARNm viables, resolviendo una serie de barreras técnicas clave en la entrega de la molécula de ARNm a la célula huésped distribuida a través de la apolipoproteína E (apoE) en el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR). ). En diciembre de 2020, Novartis anunció que los resultados positivos de los estudios de eficacia de fase III consideraron que inclisiran era un tratamiento para la hipercolesterolemia familiar heterocigótica (HeFH) y la enfermedad cardiovascular aterosclerótica (ASCVD). [141]

Conjugados

Además de las LNP, las terapias con ARNi tienen una administración dirigida a través de conjugados de ARNip (p. ej., GalNAc, carbohidratos, péptidos, aptámeros, anticuerpos). [142] Se han desarrollado terapias que utilizan conjugados de ARNip para enfermedades genéticas o raras, como la porfiria hepática aguda (AHP), la hemofilia , la hiperoxaluria primaria (HP) y la amiloidosis ATTR hereditaria, así como otras enfermedades cardiometabólicas como la hipertensión y la esteatohepatitis no alcohólica ( NASH). [143]

Biotecnología

El ARNi se ha utilizado para muchas otras aplicaciones, incluidos alimentos, cultivos e insecticidas. El uso de la vía ARNi ha desarrollado numerosos productos, como alimentos como manzanas árticas , tabaco sin nicotina, café descafeinado, plantas enriquecidas con nutrientes y cultivos hipoalergénicos. [144] [145] [146] El uso emergente de RNAi tiene el potencial de desarrollar muchos otros productos para uso futuro.

Infección viral

El tratamiento antiviral es una de las primeras aplicaciones médicas basadas en ARNi propuestas y se han desarrollado dos tipos diferentes. El primer tipo tiene como objetivo los ARN virales. Muchos estudios han demostrado que atacar los ARN virales puede suprimir la replicación de numerosos virus, incluido el VIH , [147] VPH , [148] hepatitis A , [149] hepatitis B , [150] virus de la influenza , [151] [152] [153 ] [154] virus respiratorio sincitial (VSR), [154] coronavirus del SARS (SARS-CoV), [154] adenovirus [154] y virus del sarampión . [155] La otra estrategia es bloquear las entradas virales iniciales dirigiéndose a los genes de la célula huésped. [156] Por ejemplo, la supresión de los receptores de quimiocinas ( CXCR4 y CCR5 ) en las células huésped puede prevenir la entrada viral del VIH. [157]

Cáncer

Si bien la quimioterapia tradicional puede matar eficazmente las células cancerosas, la falta de especificidad para discriminar entre células normales y cancerosas en estos tratamientos suele provocar efectos secundarios graves. Numerosos estudios han demostrado que el ARNi puede proporcionar un enfoque más específico para inhibir el crecimiento tumoral al atacar genes relacionados con el cáncer (es decir, oncogén ). [158] También se ha propuesto que el ARNi puede mejorar la sensibilidad de las células cancerosas a los agentes quimioterapéuticos , proporcionando un enfoque terapéutico combinatorio con la quimioterapia. [159] Otro posible tratamiento basado en ARNi es inhibir la invasión y migración celular . [160]

En comparación con la quimioterapia u otros medicamentos contra el cáncer, los medicamentos con ARNip tienen muchas ventajas. [161] El ARNip actúa en la etapa postranscripcional de la expresión génica, por lo que no modifica ni cambia el ADN con un efecto nocivo. [161] El ARNip también se puede utilizar para producir una respuesta específica de cierto tipo de forma, como degradando la supresión de la expresión genética. [161] En una sola célula cancerosa, el ARNip puede causar una supresión dramática de la expresión genética con solo varias copias. [161] Esto sucede silenciando genes promotores del cáncer con ARNi, además de apuntar a una secuencia de ARNm. [161]

Los medicamentos de ARNi tratan el cáncer silenciando ciertos genes promotores del cáncer. [161] Esto se hace complementando los genes del cáncer con el ARNi, como mantener las secuencias de ARNm de acuerdo con el fármaco de ARNi. [161] Idealmente, el ARNi debería inyectarse y/o modificarse químicamente para que el ARNi pueda llegar a las células cancerosas de manera más eficiente. [161] La captación y regulación del ARNi está controlada por los riñones. [161]

Enfermedades neurológicas

Las estrategias de ARNi también muestran potencial para tratar enfermedades neurodegenerativas . Los estudios en células y en ratones han demostrado que atacar específicamente los genes productores de beta amiloide (por ejemplo, BACE1 y APP) mediante ARNi puede reducir significativamente la cantidad de péptido Aβ que se correlaciona con la causa de la enfermedad de Alzheimer . [162] [163] [164] Además, estos enfoques basados ​​en el silenciamiento también proporcionan resultados prometedores en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de poliglutamina . [165] [166] [167]

Estimulación de la respuesta inmune.

El sistema inmunológico humano se divide en dos ramas separadas: el sistema inmunológico innato y el sistema inmunológico adaptativo. [168] El sistema inmunológico innato es la primera defensa contra la infección y responde a los patógenos de forma genérica. [168] Por otro lado, el sistema inmunológico adaptativo, un sistema que evolucionó más tarde que el innato, está compuesto principalmente por células B y T altamente especializadas que están entrenadas para reaccionar a porciones específicas de moléculas patógenas. [168]

El desafío entre patógenos antiguos y nuevos ha ayudado a crear un sistema de células y partículas protegidas que se denomina marco seguro. [168] Este marco ha proporcionado a los humanos un ejército de sistemas que buscan y destruyen partículas invasoras, como patógenos, organismos microscópicos, parásitos e infecciones. [168] El marco seguro para mamíferos se ha desarrollado para incorporar ARNip como herramienta para indicar contaminación viral, lo que ha permitido que el ARNip cree una intensa respuesta inmune innata. [168]

El ARNip está controlado por el sistema inmunológico innato, que se puede dividir en respuestas inflamatorias agudas y respuestas antivirales. [168] La respuesta inflamatoria se crea con señales de pequeñas moléculas de señalización o citoquinas. [168] Estos incluyen la interleucina-1 (IL-1), la interleucina-6 (IL-6), la interleucina-12 (IL-12) y el factor de necrosis tumoral α (TNF-α). [168] El sistema inmunológico innato genera inflamación y respuestas antivirales, que provocan la liberación de receptores de reconocimiento de patrones (PRR). [168] Estos receptores ayudan a etiquetar qué patógenos son virus, hongos o bacterias. [168] Además, la importancia del ARNip y el sistema inmunológico innato es incluir más PRR para ayudar a reconocer diferentes estructuras de ARN. [168] Esto hace que sea más probable que el ARNip provoque una respuesta inmunoestimulante en caso del patógeno. [168]

Alimento

El ARNi se ha utilizado para modificar genéticamente plantas para que produzcan niveles más bajos de toxinas vegetales naturales. Estas técnicas aprovechan el fenotipo de ARNi estable y hereditario en las plantas. Las semillas de algodón son ricas en proteínas dietéticas , pero contienen naturalmente el producto terpenoide tóxico gosipol , lo que las hace no aptas para el consumo humano. El ARNi se ha utilizado para producir existencias de algodón cuyas semillas contienen niveles reducidos de delta-cadineno sintasa , una enzima clave en la producción de gosipol, sin afectar la producción de la enzima en otras partes de la planta, donde el gosipol es en sí mismo importante para prevenir el daño causado por las plagas de las plantas. [169]

Los esfuerzos de desarrollo han reducido con éxito los niveles de alérgenos en las plantas de tomate [170] y el enriquecimiento de plantas como los tomates con antioxidantes dietéticos . [171] El silenciamiento por ARNi de la alfa-amilasa también se ha utilizado para disminuir el crecimiento del hongo Aspergillus flavus en el maíz, que de otro modo habría contaminado los granos con aflatoxinas peligrosas . [172] El factor lacrimógeno sintasa silenciador en las cebollas ha producido cebollas sin lágrimas y el ARNi se ha utilizado en los genes BP1 de las semillas de colza para mejorar la fotosíntesis. [173] Los genes SBEIIa y SBEIIb en el trigo han sido atacados en el trigo para producir niveles más altos de amilosa con el fin de mejorar la función intestinal, [174] y Travella et al. 2006 emplearon ARNi para genómica funcional en una investigación de razas de pan hexaploides , mientras que Scofield et al. utilizaron el silenciamiento genético inducido por virus (VIGS, un subtipo de ARNi). 2005 para investigar el mecanismo de resistencia proporcionado por Lr21 contra la roya de la hoja del trigo en trigo hexaploide . [175]

Insecticidas

El ARNi se está desarrollando como insecticida , empleando múltiples enfoques, incluida la ingeniería genética y la aplicación tópica. [4] Las células del intestino medio de algunos insectos absorben las moléculas de ARNbc en el proceso denominado ARNi ambiental. [176] En algunos insectos, el efecto es sistémico ya que la señal se propaga por todo el cuerpo del insecto (lo que se conoce como ARNi sistémico). [177]

Los animales expuestos a ARNi en dosis millones de veces superiores a los niveles de exposición humana previstos no muestran efectos adversos. [178] El ARNi tiene distintos efectos en diferentes especies de lepidópteros (mariposas y polillas). [179]

Drosophila spp., Bombyx mori , Locusta spp., Spodoptera spp., Tribolium castaneum , Nilaparvata lugens , Helicoverpa armigera y Apis mellifera son modelos que se han utilizado ampliamente para aprender cómo funciona el ARNi dentro de taxones particulares de insectos. Musca domestica tiene dos genes Ago2 y Glossina morsitans tres, como encontraron Lewis et al. 2016 y Hain et al. 2010. [180] [181] En el caso de lavía de miARN, Diuraphis noxia tiene dos Ago1 , M. domestica dos Dcr1 , Acyrthosiphon pisum dos de Ago1 y Loqs y Dcr1 y cuatro de Pasha . Mientras que en el piRNA , G. morsitans y A. pisum tienen dos o tres Ago3 s cada uno. [181] Esto ha llevado a la identificación de futuros objetivos de desarrollo de insecticidas , y los modos de acción y razones de la resistencia de otros insecticidas a los insecticidas. [181]

Plantas transgénicas

Se han creado cultivos transgénicos para expresar ARNbc, cuidadosamente seleccionados para silenciar genes cruciales en las plagas objetivo. Estos dsRNA están diseñados para afectar únicamente a insectos que expresan secuencias genéticas específicas. Como prueba de principio , en 2009 un estudio demostró que los ARN podían matar cualquiera de las cuatro especies de moscas de la fruta sin dañar las otras tres. [4]

Actual

Alternativamente, se puede suministrar ARNbc sin ingeniería genética. Un enfoque es agregarlos al agua de riego . Las moléculas son absorbidas por el sistema vascular de las plantas y envenenan a los insectos que se alimentan de ellas. Otro enfoque consiste en rociar ARNbc como un pesticida convencional. Esto permitiría una adaptación más rápida a la resistencia. Tales enfoques requerirían fuentes de ARNbc de bajo costo que no existen actualmente. [4]

Genómica funcional

Los enfoques para el diseño de bibliotecas de ARNi de todo el genoma pueden requerir más sofisticación que el diseño de un solo ARNip para un conjunto definido de condiciones experimentales. Las redes neuronales artificiales se utilizan con frecuencia para diseñar bibliotecas de ARNip [182] y para predecir su probable eficacia en la eliminación de genes. [183] ​​La detección genómica masiva se considera ampliamente como un método prometedor para la anotación del genoma y ha desencadenado el desarrollo de métodos de detección de alto rendimiento basados ​​en microarrays . [184] [185]

Detección a escala del genoma

La investigación de ARNi a escala genómica se basa en la tecnología de detección de alto rendimiento (HTS). La tecnología RNAi HTS permite la detección de pérdida de función en todo el genoma y se utiliza ampliamente en la identificación de genes asociados con fenotipos específicos. Esta tecnología ha sido aclamada como una posible segunda ola genómica, luego de la primera ola genómica de plataformas de descubrimiento de microarrays de expresión genética y polimorfismos de un solo nucleótido . [186] Una ventaja importante de la detección de ARNi a escala del genoma es su capacidad para interrogar simultáneamente miles de genes. Con la capacidad de generar una gran cantidad de datos por experimento, el cribado de ARNi a escala genómica ha provocado una explosión en las tasas de generación de datos. Explotar conjuntos de datos tan grandes es un desafío fundamental que requiere métodos estadísticos y bioinformáticos adecuados. El proceso básico de detección de ARNi basado en células incluye la elección de una biblioteca de ARNi, tipos de células robustas y estables, transfección con agentes de ARNi, tratamiento/incubación, detección de señales, análisis e identificación de genes importantes u objetivos terapéuticos. [187]

Historia

descubrimiento de ARNi

Ejemplo de plantas de petunia en las que el ARNi silencia los genes de pigmentación. La planta de la izquierda es de tipo salvaje ; las plantas adecuadas contienen transgenes que inducen la supresión de la expresión de genes endógenos y transgenes, dando lugar a las áreas blancas no pigmentadas de la flor. [188]

El proceso de ARNi se denominó "cosupresión" y "supresión" cuando se observaba antes del conocimiento de un mecanismo relacionado con el ARN. El descubrimiento del ARNi fue precedido primero por observaciones de inhibición transcripcional por ARN antisentido expresado en plantas transgénicas , [189] y más directamente por informes de resultados inesperados en experimentos realizados por científicos de plantas en los Estados Unidos y los Países Bajos a principios de los años 1990. [190] En un intento de alterar los colores de las flores en las petunias , los investigadores introdujeron copias adicionales de un gen que codifica la chalcona sintasa , una enzima clave para la pigmentación de las flores en plantas de petunia de color de flores normalmente rosadas o violetas. Se esperaba que el gen sobreexpresado diera como resultado flores más oscuras, pero en cambio provocó que algunas flores tuvieran un pigmento púrpura menos visible, a veces en patrones variados, lo que indica que la actividad de la chalcona sintasa había disminuido sustancialmente o se había suprimido de una manera específica del contexto. Esto se explicaría más tarde como el resultado de que el transgén se insertara adyacente a los promotores en la dirección opuesta en varias posiciones en los genomas de algunos transformantes, lo que conduciría a la expresión de transcritos antisentido y al silenciamiento de genes cuando estos promotores están activos. [ cita necesaria ] Otra observación temprana de ARNi provino de un estudio del hongo Neurospora crassa , [191] aunque no se reconoció de inmediato como relacionado. Una investigación más profunda del fenómeno en plantas indicó que la regulación negativa se debía a la inhibición postranscripcional de la expresión génica a través de una mayor tasa de degradación del ARNm. [192] Este fenómeno se denominó cosupresión de la expresión genética , pero el mecanismo molecular seguía siendo desconocido. [193]

No mucho después, los virólogos de plantas que trabajaban para mejorar la resistencia de las plantas a las enfermedades virales observaron un fenómeno inesperado similar. Si bien se sabía que las plantas que expresaban proteínas específicas de virus mostraban una mayor tolerancia o resistencia a la infección viral, no se esperaba que las plantas que portaban sólo regiones cortas y no codificantes de secuencias de ARN viral mostraran niveles similares de protección. Los investigadores creían que el ARN viral producido por transgenes también podría inhibir la replicación viral. [194] El experimento inverso, en el que se introdujeron secuencias cortas de genes vegetales en virus, demostró que el gen objetivo se suprimió en una planta infectada. [195] Este fenómeno se denominó "silenciamiento genético inducido por virus" (VIGS), [175] y el conjunto de tales fenómenos se denominó colectivamente silenciamiento genético postranscripcional. [196]

Tras estas observaciones iniciales en plantas, los laboratorios buscaron este fenómeno en otros organismos. [197] [198] El primer caso de silenciamiento de ARN en animales se documentó en 1996, cuando Guo y Kemphues observaron que, al introducir ARN sentido y antisentido en el ARNm par-1 en Caenorhabditis elegans, se provocaba la degradación del mensaje par-1. [199] Se pensaba que esta degradación era provocada por el ARN monocatenario (ssRNA), pero dos años más tarde, en 1998, Fire y Mello descubrieron que esta capacidad de silenciar la expresión del gen par-1 en realidad era provocada por ARN bicatenario. ARN (ARNbc). [199] El artículo de Craig C. Mello y Andrew Fire en Nature de 1998 informó sobre un potente efecto de silenciamiento genético después de inyectar ARN bicatenario en C. elegans . [200] Al investigar la regulación de la producción de proteínas musculares, observaron que ni las inyecciones de ARNm ni de ARN antisentido tenían un efecto sobre la producción de proteínas, pero el ARN bicatenario silenciaba con éxito el gen objetivo. A raíz de este trabajo acuñaron el término RNAi . Este descubrimiento representó la primera identificación del agente causante del fenómeno. Fire y Mello recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 2006 . [6] [201]

Terapéutica de ARNi

Justo después del descubrimiento innovador de Fire y Mello, Elbashir et al. descubierto, mediante el uso de pequeños ARN de interferencia (ARNip) fabricados sintéticamente, era posible apuntar al silenciamiento de secuencias específicas en un gen, en lugar de silenciar el gen completo. [202] Sólo un año después, McCaffrey y sus colegas demostraron que este silenciamiento de secuencia específica tenía aplicaciones terapéuticas al atacar una secuencia del virus de la hepatitis C en ratones transgénicos . [203] Desde entonces, varios investigadores han intentado ampliar las aplicaciones terapéuticas del ARNi, buscando específicamente apuntar a genes que causan varios tipos de cáncer . [204] [205] En 2006, las primeras aplicaciones que llegaron a ensayos clínicos fueron en el tratamiento de la degeneración macular y el virus respiratorio sincitial . [206] Cuatro años más tarde se inició el primer ensayo clínico de fase I en humanos, utilizando un sistema de administración de nanopartículas para atacar tumores sólidos . [207]

La FDA aprobó el primer fármaco basado en ARNip ( patisiran ) en 2018. Posteriormente, givosiran y lumasiran obtuvieron la aprobación de la FDA para el tratamiento de AHP y PH1 en 2019 y 2020, respectivamente. [113] Inclisiran recibió la aprobación de la EMA en 2020 para el tratamiento del colesterol alto y actualmente está bajo revisión por parte de la FDA. [208]

Ver también

Referencias

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enlaces externos

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