mancha del sur

técnica de análisis de ADN

Gel de agarosa

Bandeja con una pila compuesta de arriba hacia abajo por un peso, toallas de papel, membrana de nitrocelulosa o nailon , gel, solución salina y una losa de vidrio.

Membrana de transferencia Southern después de la hibridación y el enjuague.

Gel de agarosa Southern blot bajo iluminación ultravioleta .

Autorradiografía de transferencia Southern .

Southern blot es un método utilizado para la detección y cuantificación de una secuencia de ADN específica en muestras de ADN. Este método se utiliza en biología molecular . Brevemente, el ADN purificado de una muestra biológica (como sangre o tejido) se digiere con enzimas de restricción y los fragmentos de ADN resultantes se separan usando una corriente eléctrica para moverlos a través de un gel o matriz similar a un tamiz, lo que permite que fragmentos más pequeños se dirijan. moverse más rápido que los fragmentos más grandes. Los fragmentos de ADN se transfieren fuera del gel o matriz a una membrana sólida, que luego se expone a una sonda de ADN marcada con una etiqueta radiactiva, fluorescente o química. La etiqueta permite visualizar en la transferencia Southern cualquier fragmento de ADN que contenga secuencias complementarias con la secuencia de la sonda de ADN. ^[1]

La transferencia Southern combina la transferencia de fragmentos de ADN separados por electroforesis a una membrana filtrante en un proceso llamado transferencia y la posterior detección de fragmentos mediante hibridación de sondas . ^[2]

El método lleva el nombre del biólogo británico Edwin Southern , quien lo publicó por primera vez en 1975. ^[3] Otros métodos de transferencia (es decir, transferencia Western , ^[4] transferencia Northern , transferencia Eastern , transferencia Southwestern ) que emplean principios similares, pero usando ARN. o proteína, posteriormente recibieron el nombre de las direcciones de la brújula como una especie de juego de palabras del nombre de Southern. Como la etiqueta es epónima , Southern se escribe con mayúscula, al igual que los nombres propios convencionales . Los nombres de otros métodos de transferencia pueden seguir esta convención, por analogía. ^[5]

Historia

Southern inventó el Southern blot después de combinar tres innovaciones, la primera son las endonucleasas de restricción que fueron desarrolladas en la Universidad Johns Hopkins por Tom Kelly y Hamilton Smith , esas endonucleasas de restricción se utilizan para cortar el ADN en una secuencia específica. Kenneth y Noreen Murray introdujeron esta técnica como sureña. La segunda innovación es la electroforesis en gel, que se basa en la separación de mezclas de ADN, ARN o proteínas según el tamaño molecular, que también fue desarrollada en la Universidad Johns Hopkins por Daniel Nathans y Kathleen Danna en 1971. La tercera innovación son los métodos de transferencia. que fue desarrollado por Frederick Sanger , cuando transfirió moléculas de ARN al papel DEAE. La transferencia Southern se inventó en 1973, pero no se publicó hasta 1975. Aunque se publicó más tarde, la técnica se difundió cuando Southern presentó la técnica de la transferencia Southern a un científico del Laboratorio Cold Spring Harbor llamado Michael Mathews dibujando esta técnica en un papel. ^[6]

Método

El ADN genómico se digiere con una o más de una enzima de restricción y luego los fragmentos de ADN se fraccionan por tamaño mediante electroforesis en gel. Antes de que los fragmentos de ADN se transfieran a una membrana sólida, que es de nailon o de nitrocelulosa, primero se desnaturaliza mediante un tratamiento alcalino. ^[7] Después de que los fragmentos de ADN se inmovilizan en la membrana, se utilizan métodos de prehibridación para reducir la unión no específica de la sonda y luego los fragmentos en la membrana se hibridan con sondas de ADN, ARN u oligonucleótidos radiomarcadas o no radioactivas que son complementarias a la membrana. secuencia de ADN objetivo, luego se utilizan métodos de detección para visualizar el ADN objetivo. ^[8]

1. Aislamiento de ADN: El ADN a estudiar se aísla de diversos tejidos. La fuente más adecuada de ADN se conoce como tejido sanguíneo. Sin embargo, se puede aislar de diferentes tejidos (pelo, semen, saliva, etc.).
2. Digestión del ADN: las endonucleasas de restricción se utilizan para cortar hebras de ADN de alto peso molecular en fragmentos más pequeños. Esto se hace agregando la cantidad deseada de ADN que se puede cambiar según la sonda utilizada y la complejidad del ADN, con la enzima de restricción, el tampón enzimático y el agua purificada y luego se incuba la reacción a 37 °C durante la noche.
3. Electroforesis en gel: los fragmentos de ADN se someten a electroforesis en un gel de agarosa para separarlos por tamaño. Si algunos de los fragmentos de ADN tienen más de 15 kb , antes de la transferencia, el gel puede tratarse con un ácido, como HCl diluido . Esto despurina los fragmentos de ADN, rompiéndolos en trozos más pequeños, permitiendo así una transferencia más eficiente del gel a la membrana.
4. Desnaturalización: si se utilizan métodos de transferencia alcalina, el gel de ADN se coloca en una solución alcalina (que normalmente contiene hidróxido de sodio ) para desnaturalizar el ADN bicatenario. La desnaturalización en un ambiente alcalino puede mejorar la unión de los residuos de timina cargados negativamente del ADN a grupos amino cargados positivamente de la membrana, separándolos en hebras individuales de ADN para su posterior hibridación con la sonda (ver más abajo), y destruye cualquier ARN residual que pueda todavía estar presente en el ADN. Sin embargo, la elección de métodos de transferencia alcalinos en lugar de neutros suele ser empírica y puede dar lugar a resultados equivalentes. ^{[ cita necesaria ]}
5. Secante: se coloca una lámina de membrana de nitrocelulosa (o, alternativamente, nailon ) encima (o debajo, dependiendo de la dirección de la transferencia) del gel. Se aplica presión constantemente al gel (ya sea mediante succión o colocando una pila de toallas de papel y un peso encima de la membrana y el gel), para garantizar un contacto bueno y uniforme entre el gel y la membrana. Si se transfiere mediante succión, se utiliza tampón 20X SSC para garantizar un sellado y evitar que el gel se seque. Luego se utiliza la transferencia de tampón por acción capilar desde una región de alto potencial hídrico a una región de bajo potencial hídrico (generalmente papel de filtro y pañuelos de papel) para mover el ADN del gel a la membrana; Las interacciones de intercambio iónico unen el ADN a la membrana debido a la carga negativa del ADN y la carga positiva de la membrana. Se pueden utilizar cinco métodos para transferir fragmentos de ADN a la membrana sólida y son: ^[8] 1. Transferencia capilar ascendente: este método transfiere el fragmento de ADN hacia arriba desde el gel a la membrana donde se realizará el flujo del líquido o del tampón. hacia arriba, 2. Transferencia capilar descendente: este método se realiza colocando el gel en la superficie de la membrana (generalmente membrana cargada de nailon) y los fragmentos de ADN se transferirán en dirección descendente con el flujo del tampón alcalino, 3. Simultáneo Transferencia a dos membranas: este método se utiliza para transferir fragmentos de ADN de alta concentración simultáneamente desde el gel a dos membranas. 4. Transferencia electroforética: este método generalmente utiliza una gran corriente eléctrica que dificulta la transferencia eficiente del ADN debido a la temperatura de el tampón utilizado, por lo que estas máquinas pueden equiparse con máquinas de enfriamiento o usarse en un área fría. 5. Transferencia al vacío: este método utiliza un tampón de la cámara superior para transferir el ADN del gel a la membrana de nitrocelulosa o nailon, el El gel se coloca directamente sobre la membrana y la membrana se coloca sobre una pantalla porosa en la cámara de vacío.
6. Inmovilización: Luego, la membrana se cuece al vacío o en un horno normal a 80 °C durante 2 horas (condiciones estándar; nitrocelulosa o membrana de nailon) o se expone a radiación ultravioleta (membrana de nailon) para unir permanentemente el ADN transferido a la membrana.
7. Hibridación: después de eso, se expone a la membrana una sonda de hibridación (un único fragmento de ADN con una secuencia particular cuya presencia en el ADN objetivo se va a determinar). El ADN de la sonda se marca para que pueda detectarse, generalmente incorporando radiactividad o marcando la molécula con un tinte fluorescente o cromogénico . En algunos casos, la sonda de hibridación puede fabricarse a partir de ARN, en lugar de ADN. Para garantizar la especificidad de la unión de la sonda al ADN de la muestra, los métodos de hibridación más comunes utilizan ADN de esperma de salmón o arenque para bloquear la superficie de la membrana y el ADN objetivo, formamida desionizada y detergentes como SDS para reducir la unión no específica de la sonda.
8. Detección: Después de la hibridación, el exceso de sonda se lava de la membrana (normalmente usando tampón SSC ) y el patrón de hibridación se visualiza en una película de rayos X mediante autorradiografía en el caso de una sonda radiactiva o fluorescente, o mediante el desarrollo de color en la membrana. membrana si se utiliza un método de detección cromogénico.

interpretación de resultados

La hibridación de la sonda con un fragmento de ADN específico en la membrana del filtro indica que este fragmento contiene una secuencia de ADN que es complementaria a la sonda. La etapa de transferencia del ADN desde el gel de electroforesis a una membrana permite una fácil unión de la sonda de hibridación marcada al ADN fraccionado por tamaño. También permite la fijación de los híbridos objetivo-sonda, necesarios para el análisis mediante autorradiografía u otros métodos de detección. Las transferencias Southern realizadas con ADN genómico digerido con enzimas de restricción se pueden usar para determinar el número de secuencias (p. ej., copias de genes) en un genoma . Una sonda que se hibrida sólo con un único segmento de ADN que no ha sido cortado por la enzima de restricción producirá una única banda en una transferencia Southern, mientras que probablemente se observarán múltiples bandas cuando la sonda se hibrida con varias secuencias muy similares (p. ej., aquellas que puede ser el resultado de la duplicación de secuencia). Para mejorar la especificidad y reducir la hibridación de la sonda con secuencias que son menos del 100 % idénticas, se pueden cambiar los parámetros de hibridación (por ejemplo, aumentando la temperatura de hibridación o reduciendo el contenido de sal). La membrana de nailon es más duradera y tiene una mayor capacidad de unión a fragmentos de ADN que la membrana de nitrocelulosa, por lo que los fragmentos de ADN estarán más fijados a la membrana incluso cuando la membrana se incuba a altas temperaturas. Además, en comparación con la membrana de nitrocelulosa que requiere un tampón de alta fuerza iónica para unir los fragmentos de ADN a la membrana, las membranas cargadas de nailon utilizan tampones con muy baja fuerza iónica para transferir incluso pequeños fragmentos de ADN de aproximadamente 50 pb a la membrana, generalmente el ADN a transferir se separa mediante gel de poliacrilamida. En el paso de transferencia, el método más eficaz para transferir el ADN del gel a la membrana es la transferencia al vacío, ya que transfiere el ADN de forma más rápida y cuantitativa. ^[8]

Aplicaciones

1. La transferencia por transferencia Southern se puede utilizar para la clonación basada en homología basada en la secuencia de aminoácidos del producto proteico del gen diana. Los oligonucleótidos están diseñados para que sean complementarios a la secuencia objetivo. Los oligonucleótidos se sintetizan químicamente, se radiomarcan y se utilizan para examinar una biblioteca de ADN u otras colecciones de fragmentos de ADN clonados. Las secuencias que se hibridan con la sonda de hibridación se analizan adicionalmente, por ejemplo, para obtener la secuencia de longitud completa del gen diana.
2. Mediante esta técnica se puede estudiar el reordenamiento cromosómico o genético normal. ^[7]
3. Puede usarse para encontrar secuencias similares en otras especies o en el genoma disminuyendo la especificidad de la hibridación. ^[7]
4. En una mezcla que tiene diferentes tamaños de ADN digerido, se utiliza para identificar el fragmento de restricción de un tamaño específico. ^[7]
5. Es útil para identificar cambios que ocurren en genes, incluidas inserciones, reordenamientos, deleciones y mutaciones puntuales que afectan los sitios de restricción. ^[7]
6. Además, se utiliza para identificar una región específica que utiliza muchas enzimas de restricción diferentes en un mapeo de restricción. También se utiliza para determinar qué sitio de reconocimiento ha sido alterado debido a un polimorfismo de un solo nucleótido que cambia una enzima de restricción específica. ^[7]
7. La transferencia Southern también se puede utilizar para identificar sitios metilados en genes particulares. Particularmente útiles son las nucleasas de restricción MspI y HpaII , las cuales reconocen y escinden dentro de la misma secuencia. Sin embargo, HpaII requiere que una C dentro de ese sitio esté metilada, mientras que MspI escinde sólo el ADN no metilado en ese sitio. Por lo tanto, cualquier sitio metilado dentro de una secuencia analizada con una sonda particular será escindido por la primera enzima, pero no por la última. ^[9]
8. Puede utilizarse en la identificación personal mediante toma de huellas dactilares y en el diagnóstico de enfermedades. ^[10]

Limitaciones

1. En comparación con otras pruebas, la transferencia Southern es una técnica compleja que tiene múltiples pasos y estos pasos requieren equipos y reactivos costosos. ^[10]
2. Se necesita ADN de alta calidad y en grandes cantidades. ^[10]
3. La transferencia Southern es un método que requiere mucho tiempo y sólo puede estimar el tamaño del ADN, ya que es un método semicuantitativo. ^[10]
4. No se puede utilizar para detectar mutaciones a nivel de pares de bases. ^[10]

Ver también

• Electroforesis en gel de ácidos nucleicos.
• Fragmento de restricción
• Huella genética
• mancha norte
• mancha occidental
• mancha oriental
• mancha del suroeste
• mancha del noroeste

Referencias

1. "Glosario parlante de términos genéticos | NHGRI". www.genoma.gov . Institutos Nacionales de Salud . Consultado el 24 de enero de 2023 . Este artículo incorpora texto de esta fuente, que se encuentra en el dominio público .
2. "Mancha del Sur".
3. Sur, Edwin Mellor (5 de noviembre de 1975). "Detección de secuencias específicas entre fragmentos de ADN separados mediante electroforesis en gel". Revista de biología molecular . 98 (3): 503–517. doi :10.1016/S0022-2836(75)80083-0. ISSN  0022-2836. PMID  1195397. S2CID  20126741.
4. Papelera de remolque; Staehelin, T; Gordon, J; et al. (1979). "Transferencia electroforética de proteínas desde geles de poliacrilamida a láminas de nitrocelulosa: procedimiento y algunas aplicaciones". PNAS . 76 (9): 4350–4. Código bibliográfico : 1979PNAS...76.4350T. doi : 10.1073/pnas.76.9.4350 . PMC 411572 . PMID  388439. 
5. Burnette, W. Neal (abril de 1981). "Western Blot: transferencia electroforética de proteínas de geles de poliacrilamida y dodecil sulfato de sodio a nitrocelulosa no modificada y detección radiográfica con anticuerpo y proteína A radioyodada". Bioquímica Analítica . 112 (2): 195-203. doi :10.1016/0003-2697(81)90281-5. ISSN  0003-2697. PMID  6266278.
6. Tofano, Daidree; Wiechers, Ilse R.; Cook-Deegan, Robert (15 de agosto de 2006). "Edwin Southern, transferencia de ADN y tecnología de microarrays: un estudio de caso sobre el papel cambiante de las patentes en la biología molecular académica". Genómica, sociedad y política . 2 (2). doi : 10.1186/1746-5354-2-2-50 . ISSN  1746-5354. PMC 5424904 . 
7. , Gary; Andreou, Lefkothea-Vasiliki (1 de enero de 2013), "Capítulo cinco: análisis de ADN mediante transferencia Southern", en Lorsch, Jon (ed.), ADN, vol. 529, Academic Press, págs. 47–63, doi :10.1016/b978-0-12-418687-3.00005-7, ISBN 9780124186873, PMID  24011036 , consultado el 4 de enero de 2023
8. C Verde, Michael R.; Sambrook, Joseph (julio de 2021). "Análisis de ADN mediante transferencia Southern". Protocolos de Cold Spring Harbor . 2021 (7): pdb.top100396. doi : 10.1101/pdb.top100396 . ISSN  1940-3402. PMID  34210774. S2CID  235710916.
9. Bioquímica, tercera edición, Matthews, Van Holde et al, Addison Wesley Publishing, página 977
10. Sapkota, Anupama (3 de junio de 2021). "Southern Blot: definición, principio, pasos, resultados, aplicaciones". Notas de microbios . Consultado el 4 de enero de 2023 .

enlaces externos

• OpenWetWare