En biología molecular , una sonda de hibridación ( HP ) es un fragmento de ADN o ARN , normalmente de 15 a 10.000 nucleótidos de longitud, que puede marcarse radiactiva o fluorescentemente . Los HP se pueden utilizar para detectar la presencia de secuencias de nucleótidos en el ARN o ADN analizado que son complementarias a la secuencia de la sonda. [1] La sonda marcada primero se desnaturaliza (mediante calentamiento o en condiciones alcalinas , como exposición a hidróxido de sodio ) en ADN monocatenario (ADNss) y luego se hibrida con el ADNss ( transferencia Southern ) o ARN ( transferencia Northern ) objetivo inmovilizado en un membrana o in situ .
Para detectar la hibridación de la sonda con su secuencia diana, la sonda se etiqueta (o "marca") con un marcador molecular de moléculas radiactivas o (más recientemente) fluorescentes. Los marcadores comúnmente utilizados son el 32 P (un isótopo radiactivo del fósforo incorporado en el enlace fosfodiéster del ADN de la sonda), la digoxigenina , un marcador no radiactivo basado en anticuerpos , la biotina o la fluoresceína. Las secuencias de ADN o transcritos de ARN que tienen una similitud de secuencia de moderada a alta con la sonda se detectan visualizando la sonda hibridada mediante autorradiografía u otras técnicas de obtención de imágenes. Normalmente, se toman fotografías de rayos X del filtro o se coloca el filtro bajo luz ultravioleta. La detección de secuencias con similitud moderada o alta depende de qué tan estrictas se aplicaron las condiciones de hibridación: las condiciones de hibridación altas, como una temperatura de hibridación alta y un contenido bajo de sal en los tampones de hibridación, sólo permiten la hibridación entre secuencias de ácidos nucleicos que son muy similares, mientras que las secuencias con una similitud moderada o alta, como como temperatura más baja y sal alta, permite la hibridación cuando las secuencias son menos similares.
Las sondas de hibridación utilizadas en micromatrices de ADN se refieren al ADN unido covalentemente a una superficie inerte, como portaobjetos de vidrio recubiertos o chips genéticos , con los que se hibrida una diana de ADNc móvil . Dependiendo del método , la sonda puede sintetizarse mediante el método de la fosforamidita o puede generarse y marcarse mediante amplificación por PCR o clonación (ambos son métodos más antiguos). Para aumentar la estabilidad in vivo de la sonda, no se utiliza ARN. En su lugar, se pueden utilizar análogos de ARN , en particular derivados de morfolino . Las sondas moleculares basadas en ADN o ARN se utilizan habitualmente en la detección de bibliotecas de genes, la detección de secuencias de nucleótidos con métodos de transferencia y en otras tecnologías genéticas, como microarrays de ácidos nucleicos y tejidos .
Dentro del campo de la ecología microbiana , las sondas de oligonucleótidos se utilizan con el fin de determinar la presencia de especies, géneros o microorganismos microbianos clasificados a un nivel más amplio, como bacterias , arqueas y eucariotas mediante hibridación fluorescente in situ (FISH). [2] Las sondas de ARNr han permitido a los científicos visualizar microorganismos, aún por cultivar en entornos de laboratorio, mediante la recuperación de secuencias de ARNr directamente del medio ambiente. [3] Ejemplos de estos tipos de microorganismos incluyen:
En algunos casos, la diferenciación entre especies puede resultar problemática cuando se utilizan secuencias de ARNr 16S debido a la similitud. En tales casos, el ARNr 23S puede ser una mejor alternativa. [6] La biblioteca estándar global de secuencias de ARNr crece constantemente y se actualiza continuamente, y por lo tanto, la posibilidad de un evento de hibridación aleatoria entre una sonda diseñada específicamente (basada en datos completos y actuales de una variedad de organismos de prueba) y una Un organismo objetivo no deseado/desconocido no se puede descartar fácilmente. [7] Por el contrario, es plausible que existan microorganismos, aún por identificar, que son filogenéticamente miembros de un grupo objetivo de sonda, pero que tienen sitios objetivo parciales o casi perfectos, lo que generalmente se aplica al diseñar sondas específicas de grupo.
Probablemente la mayor limitación práctica de esta técnica es la falta de automatización disponible. [8]
En la ciencia forense, las sondas de hibridación se utilizan, por ejemplo, para la detección de regiones con repeticiones cortas en tándem ( microsatélites ) [9] y en métodos de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción ( RFLP ), todos los cuales se utilizan ampliamente como parte del análisis de perfiles de ADN .