Estructura química de un monómero de LNA: un puente adicional une el oxígeno 2' y el carbono 4' de la pentosa
Un ácido nucleico bloqueado ( LNA ), también conocido como ácido nucleico puenteado (BNA), [1] y a menudo denominado ARN inaccesible , es un nucleótido de ARN modificado en el que la porción ribosa se modifica con un puente adicional que conecta el oxígeno 2'. y carbono 4'. El puente "bloquea" la ribosa en la conformación endo 3' (Norte), que a menudo se encuentra en los dúplex en forma de A. Esta estructura proporciona una mayor estabilidad frente a la degradación enzimática. [2] [3] [4] [5] El LNA también ofrece especificidad y afinidad mejoradas en el emparejamiento de bases como monómero o constituyente de un oligonucleótido. [6] Los nucleótidos de LNA se pueden mezclar con residuos de ADN o ARN en un oligonucleótido.
Síntesis
Obika et al. fueron los primeros en sintetizar químicamente LNA en 1997, [7] seguidos de forma independiente por el grupo de Jesper Wengel en 1998. [8] Esto fue posible después de que Zamecnick y Stephenson sentaron las bases sobre la posibilidad de que los oligonucleótidos fueran grandes agentes para controlar la expresión genética en 1978. [9] Hasta la fecha, se ha demostrado que dos enfoques diferentes, denominados estrategias lineales y convergentes respectivamente, producen LNA eficientes y de alto rendimiento. La estrategia lineal de síntesis se detalló por primera vez en los trabajos de Obika et al. [7] En este enfoque, se puede utilizar uridina (o cualquier nucleósido de ARN fácilmente disponible) como material de partida. La estrategia convergente requiere la síntesis de un azúcar intermedio que sirve como donador de glicosilo necesario para el acoplamiento con nucleobases . Comúnmente, la D-glucosa se usa para producir el azúcar intermedio que posteriormente se hace reaccionar con nucleobases utilizando un procedimiento de Vorbrügen modificado que permite el acoplamiento estereoselectivo. [10]
La adición de diferentes restos sigue siendo una posibilidad con el mantenimiento de propiedades fisicoquímicas clave, como la alta afinidad y especificidad evidentes en el LNA sintetizado originalmente. [8] Estos oligómeros se sintetizan químicamente y están disponibles comercialmente.
Incorporación al ADN/ARN
El LNA se puede incorporar al ADN y al ARN utilizando la promiscuidad de ciertas ADN y ARN polimerasas. La ADN polimerasa Phusion, una enzima diseñada comercialmente basada en una ADN polimerasa Pfu , incorpora eficientemente LNA en el ADN. [11]
Propiedades
El LNA ofrece una bioestabilidad mejorada en comparación con los ácidos nucleicos biológicos . Los oligonucleótidos modificados con LNA han demostrado una termodinámica mejorada en la hibridación con ARN , ssDNA y dsDNA . [11]
Aplicaciones
LNAzimas
Las ADNzimas se pueden modificar para incluir residuos de LNA, produciendo LNAzimas (ADNzimas modificadas con LNA). Estos oligonucleótidos modificados, al igual que sus parientes ADNzimas, son generalmente endonucleasas que se unen a secuencias diana de ARN específicas y escinden el enlace fosfodiéster que existe entre los nucleótidos. [12] Sin embargo, demuestran una escisión más eficiente de los enlaces fosfodiéster en comparación con sus homólogos no modificados. [13] La modificación de los brazos de reconocimiento de sustrato de las ADNzimas con monómeros de LNA produce una LNAzima que reconoce el virus coxsackie A21 (CAV-21) y escinde su secuencia diana de ARN similar a una en la región 5' no traducida (5' UTR) del rinovirus humano. -14 (VFC-14); una secuencia no reconocida por las ADNzimas no modificadas. [14]
Terapéutica
El uso terapéutico de oligonucleótidos basados en LNA es un campo emergente en biotecnología . [15] Se han evaluado diversos oligonucleótidos de LNA por sus perfiles farmacocinéticos y de toxicidad. Los estudios concluyeron que la toxicidad de los LNA es generalmente independiente de la secuencia de oligonucleótidos y muestra un perfil de seguridad preferencial para aplicaciones terapéuticas traducibles. [8]
El LNA ha sido investigado por sus propiedades terapéuticas en el tratamiento de cánceres y enfermedades infecciosas. Se ha desarrollado una molécula antisentido de fosforotioato de ácido nucleico bloqueada, denominada SPC2996, para apuntar al ARNm que codifica la oncoproteína Bcl-2, una proteína que inhibe la apoptosis en las células de leucemia linfocítica crónica (LLC). Los ensayos clínicos de fase I y II demostraron una reducción dependiente de la dosis en las células de CLL circulantes en aproximadamente el 30 % de la población de la muestra, lo que sugiere una mayor investigación sobre SPC2996. [dieciséis]
El LNA también se ha aplicado a Miravirsen , un terapéutico experimental destinado al tratamiento de la hepatitis C , que constituye una secuencia de fosforotioato de 15 nucleótidos con especificidad de unión por MiR-122 (un miARN expresado en hepatocitos ). [17] [18]
Detección y diagnóstico
La PCR específica de alelo utilizando LNA permite el diseño de cebadores más cortos, sin comprometer la especificidad de unión. [19]
El LNA se ha incorporado en la hibridación fluorescente in situ (FISH) . [20] FISH es una técnica común utilizada para visualizar material genético en una variedad de células, pero los estudios señalaron que esta técnica se ha visto limitada por la baja eficiencia de hibridación de la sonda. Por el contrario, las sondas incorporadas con LNA demostraron una mayor eficiencia de hibridación tanto en ADN como en ARN . La eficiencia mejorada del FISH incorporado con LNA ha dado como resultado el análisis FISH del cromosoma humano, varios tipos de células no humanas y micromatrices. [20]
También se han realizado ensayos de genotipado de LNA, específicamente para detectar una mutación en la apolipoproteína B. [20]
Por su alta afinidad por la discriminación de desajustes, el LNA ha sido estudiado para sus aplicaciones en herramientas de diagnóstico. Se han introducido sondas de LNA inmovilizadas en un ensayo de genotipado de SNP múltiple . [15]
Edición de genes
Los ssODN (oligonucleótidos de ADN monocatenarios sintéticos) modificados con LNA se pueden utilizar como ssODN ordinarios para la edición de genes de una sola base. El uso de LNA en el sitio de modificación previsto o cerca de él ofrece evasión de la reparación de errores de coincidencia del ADN debido a la mayor estabilidad termodinámica que tiene. [21]
Referencias
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