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Ácido nucleico bloqueado

Estructura química de un monómero de LNA: un puente adicional une el oxígeno 2' y el carbono 4' de la pentosa

Un ácido nucleico bloqueado ( LNA ), también conocido como ácido nucleico puenteado (BNA), [1] y a menudo denominado ARN inaccesible , es un nucleótido de ARN modificado en el que la porción ribosa se modifica con un puente adicional que conecta el oxígeno 2'. y carbono 4'. El puente "bloquea" la ribosa en la conformación endo 3' (Norte), que a menudo se encuentra en los dúplex en forma de A. Esta estructura proporciona una mayor estabilidad frente a la degradación enzimática. [2] [3] [4] [5] El LNA también ofrece especificidad y afinidad mejoradas en el emparejamiento de bases como monómero o constituyente de un oligonucleótido. [6] Los nucleótidos de LNA se pueden mezclar con residuos de ADN o ARN en un oligonucleótido.

Síntesis

Obika et al. fueron los primeros en sintetizar químicamente LNA en 1997, [7] seguidos de forma independiente por el grupo de Jesper Wengel en 1998. [8] Esto fue posible después de que Zamecnick y Stephenson sentaron las bases sobre la posibilidad de que los oligonucleótidos fueran grandes agentes para controlar la expresión genética en 1978. [9] Hasta la fecha, se ha demostrado que dos enfoques diferentes, denominados estrategias lineales y convergentes respectivamente, producen LNA eficientes y de alto rendimiento. La estrategia lineal de síntesis se detalló por primera vez en los trabajos de Obika et al. [7] En este enfoque, se puede utilizar uridina (o cualquier nucleósido de ARN fácilmente disponible) como material de partida. La estrategia convergente requiere la síntesis de un azúcar intermedio que sirve como donador de glicosilo necesario para el acoplamiento con nucleobases . Comúnmente, la D-glucosa se usa para producir el azúcar intermedio que posteriormente se hace reaccionar con nucleobases utilizando un procedimiento de Vorbrügen modificado que permite el acoplamiento estereoselectivo. [10]

La adición de diferentes restos sigue siendo una posibilidad con el mantenimiento de propiedades fisicoquímicas clave, como la alta afinidad y especificidad evidentes en el LNA sintetizado originalmente. [8] Estos oligómeros se sintetizan químicamente y están disponibles comercialmente.

Incorporación al ADN/ARN

El LNA se puede incorporar al ADN y al ARN utilizando la promiscuidad de ciertas ADN y ARN polimerasas. La ADN polimerasa Phusion, una enzima diseñada comercialmente basada en una ADN polimerasa Pfu , incorpora eficientemente LNA en el ADN. [11]

Propiedades

El LNA ofrece una bioestabilidad mejorada en comparación con los ácidos nucleicos biológicos . Los oligonucleótidos modificados con LNA han demostrado una termodinámica mejorada en la hibridación con ARN , ssDNA y dsDNA . [11]

Aplicaciones

LNAzimas

Las ADNzimas se pueden modificar para incluir residuos de LNA, produciendo LNAzimas (ADNzimas modificadas con LNA). Estos oligonucleótidos modificados, al igual que sus parientes ADNzimas, son generalmente endonucleasas que se unen a secuencias diana de ARN específicas y escinden el enlace fosfodiéster que existe entre los nucleótidos. [12] Sin embargo, demuestran una escisión más eficiente de los enlaces fosfodiéster en comparación con sus homólogos no modificados. [13] La modificación de los brazos de reconocimiento de sustrato de las ADNzimas con monómeros de LNA produce una LNAzima que reconoce el virus coxsackie A21 (CAV-21) y escinde su secuencia diana de ARN similar a una en la región 5' no traducida (5' UTR) del rinovirus humano. -14 (VFC-14); una secuencia no reconocida por las ADNzimas no modificadas. [14]

Terapéutica

El uso terapéutico de oligonucleótidos basados ​​en LNA es un campo emergente en biotecnología . [15] Se han evaluado diversos oligonucleótidos de LNA por sus perfiles farmacocinéticos y de toxicidad. Los estudios concluyeron que la toxicidad de los LNA es generalmente independiente de la secuencia de oligonucleótidos y muestra un perfil de seguridad preferencial para aplicaciones terapéuticas traducibles. [8]

El LNA ha sido investigado por sus propiedades terapéuticas en el tratamiento de cánceres y enfermedades infecciosas. Se ha desarrollado una molécula antisentido de fosforotioato de ácido nucleico bloqueada, denominada SPC2996, para apuntar al ARNm que codifica la oncoproteína Bcl-2, una proteína que inhibe la apoptosis en las células de leucemia linfocítica crónica (LLC). Los ensayos clínicos de fase I y II demostraron una reducción dependiente de la dosis en las células de CLL circulantes en aproximadamente el 30 % de la población de la muestra, lo que sugiere una mayor investigación sobre SPC2996. [dieciséis]

El LNA también se ha aplicado a Miravirsen , un terapéutico experimental destinado al tratamiento de la hepatitis C , que constituye una secuencia de fosforotioato de 15 nucleótidos con especificidad de unión por MiR-122 (un miARN expresado en hepatocitos ). [17] [18]

Detección y diagnóstico

La PCR específica de alelo utilizando LNA permite el diseño de cebadores más cortos, sin comprometer la especificidad de unión. [19]

El LNA se ha incorporado en la hibridación fluorescente in situ (FISH) . [20] FISH es una técnica común utilizada para visualizar material genético en una variedad de células, pero los estudios señalaron que esta técnica se ha visto limitada por la baja eficiencia de hibridación de la sonda. Por el contrario, las sondas incorporadas con LNA demostraron una mayor eficiencia de hibridación tanto en ADN como en ARN . La eficiencia mejorada del FISH incorporado con LNA ha dado como resultado el análisis FISH del cromosoma humano, varios tipos de células no humanas y micromatrices. [20]

También se han realizado ensayos de genotipado de LNA, específicamente para detectar una mutación en la apolipoproteína B. [20]

Por su alta afinidad por la discriminación de desajustes, el LNA ha sido estudiado para sus aplicaciones en herramientas de diagnóstico. Se han introducido sondas de LNA inmovilizadas en un ensayo de genotipado de SNP múltiple . [15]

Edición de genes

Los ssODN (oligonucleótidos de ADN monocatenarios sintéticos) modificados con LNA se pueden utilizar como ssODN ordinarios para la edición de genes de una sola base. El uso de LNA en el sitio de modificación previsto o cerca de él ofrece evasión de la reparación de errores de coincidencia del ADN debido a la mayor estabilidad termodinámica que tiene. [21]

Referencias

  1. ^ Elayadi, Anissa N.; Braasch, Dwaine A.; Corey, David R. (agosto de 2002). "Implicaciones de la hibridación de alta afinidad por oligómeros de ácidos nucleicos bloqueados para la inhibición de la telomerasa humana †". Bioquímica . 41 (31): 9973–9981. doi :10.1021/bi025907j. ISSN  0006-2960. PMID  12146961.
  2. ^ Kurreck, J. (1 de mayo de 2002). "Diseño de oligonucleótidos antisentido estabilizados por ácidos nucleicos bloqueados". Investigación de ácidos nucleicos . 30 (9): 1911-1918. doi :10.1093/nar/30.9.1911. PMC 113840 . PMID  11972327. 
  3. ^ Frieden, M. (1 de noviembre de 2003). "Ampliando el horizonte de diseño de oligonucleótidos antisentido con alfa-L-LNA". Investigación de ácidos nucleicos . 31 (21): 6365–6372. doi :10.1093/nar/gkg820. ISSN  1362-4962. PMC 275462 . PMID  14576324. 
  4. ^ Frieden, Miriam; Hansen, Henrik F.; Koch, Troels (octubre de 2003). "Estabilidad de nucleasas de oligonucleótidos de LNA y quimeras de ADN-LNA". Nucleósidos, Nucleótidos y Ácidos Nucleicos . 22 (5–8): 1041–1043. doi : 10.1081/NCN-120022731. ISSN  1525-7770. PMID  14565339. S2CID  10631717.
  5. ^ Morita, K.; Hasegawa, C.; Kaneko, M.; Tsutsumi, S.; Sone, J.; Ishikawa, T.; Imanishi, T.; Koizumi, M. (1 de noviembre de 2001). "Ácidos nucleicos con puente de etileno (ENA) 2'-O, 4'-C-con resistencia a nucleasas y alta afinidad por el ARN". Serie de simposios sobre ácidos nucleicos . 1 (1): 241–242. doi : 10.1093/nass/1.1.241 . ISSN  0261-3166. PMID  12836354.
  6. ^ Veedu, Rakesh; Wengel, Jesper (2011). Química Medicinal de los Ácidos Nucleicos . John Wiley & Sons, Inc. págs. 335–337. ISBN 978-0470596685.
  7. ^ ab Obika, Satoshi; Nanbu, Daishu; Hari, Yoshiyuki; Morio, Ken-ichiro; En, Yasuko; Ishida, Toshimasa; Imanishi, Takeshi (15 de diciembre de 1997). "Síntesis de 2′-O,4′-C-metilenuridina y -citidina. Nuevos nucleósidos bicíclicos que tienen un fruncimiento de azúcar endo C3 fijo". Letras de tetraedro . 38 (50): 8735–8738. doi :10.1016/S0040-4039(97)10322-7. ISSN  0040-4039.
  8. ^ abc Orum, Miriam Frieden y Henrik (31 de marzo de 2008). "El ácido nucleico bloqueado es prometedor en el tratamiento del cáncer". Diseño farmacéutico actual . 14 (11): 1138-1142. doi :10.2174/138161208784246234. PMID  18473860 . Consultado el 6 de octubre de 2020 .
  9. ^ Zamecnik, ordenador personal; Stephenson, ML (1 de enero de 1978). "Inhibición de la replicación del virus del sarcoma de Rous y transformación celular por un oligodesoxinucleótido específico". Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias . 75 (1): 280–284. Código bibliográfico : 1978PNAS...75..280Z. doi : 10.1073/pnas.75.1.280 . ISSN  0027-8424. PMC 411230 . PMID  75545. 
  10. ^ Koshkin, Alexei A.; Fensholdt, Jef; Pfundheller, Henrik M.; Lomholt, cristiano (1 de diciembre de 2001). "Una ruta simplificada y eficiente hacia los ribonucleósidos bicíclicos unidos a 2'-O, 4'-C-metileno (ácido nucleico bloqueado)". La Revista de Química Orgánica . 66 (25): 8504–8512. doi :10.1021/jo010732p. ISSN  0022-3263. PMID  11735531.
  11. ^ ab Veedu, Rakesh N.; Vester, Birte; Wengel, Jesper (26 de marzo de 2007). "Incorporación enzimática de nucleótidos de LNA en hebras de ADN". ChemBioChem . 8 (5): 490–492. doi :10.1002/cbic.200600501. PMID  17315250. S2CID  10206060.
  12. ^ Disyuntor, RR; Joyce, GF (diciembre de 1994). "Una enzima de ADN que escinde el ARN". Química y Biología . 1 (4): 223–229. doi :10.1016/1074-5521(94)90014-0. ISSN  1074-5521. PMID  9383394.
  13. ^ Vester, Birte; Lundberg, Lars Bo; Sørensen, Mads D.; Babu, B. Ravindra; Douthwaite, Stephen; Wengel, Jesper (noviembre de 2002). "LNAzimas: la incorporación de monómeros de tipo LNA en ADNzimas aumenta notablemente la escisión del ARN". Revista de la Sociedad Química Estadounidense . 124 (46): 13682–13683. doi :10.1021/ja0276220. ISSN  0002-7863. PMID  12431091.
  14. ^ Schubert, Steffen; Fürste, Jens P; Trabajo, Denise; Grunert, Hans-Peter; Zeichhardt, Heinz; Erdmann, Volker A; Kurreck, Jens (mayo de 2004). "Obtener acceso objetivo para las desoxirribozimas". Revista de biología molecular . 339 (2): 355–363. doi :10.1016/j.jmb.2004.03.064. PMID  15136038.
  15. ^ ab Petersen M, Wengel J (febrero de 2003). "LNA: una herramienta versátil para terapéutica y genómica". Tendencias en Biotecnología . 21 (2): 74–81. doi :10.1016/S0167-7799(02)00038-0. PMID  12573856.
  16. ^ Dürig, J.; Dührsen, U.; Klein-Hitpass, L.; Gusano, J.; Hansen, JB Rode; Ørum, H.; Wissenbach, M. (abril de 2011). "El nuevo inhibidor antisentido de Bcl-2 SPC2996 provoca una rápida eliminación de las células leucémicas y activación inmune en la leucemia linfocítica crónica". Leucemia . 25 (4): 638–647. doi :10.1038/leu.2010.322. ISSN  1476-5551. PMID  21358717.
  17. ^ Gebert, Luca FR; Rebhan, Mario AE; Crivelli, Silvia EM; Denzler, Rémy; Stoffel, Markus; Salón, Jonathan (1 de enero de 2014). "Miravirsen (SPC3649) puede inhibir la biogénesis de miR-122". Investigación de ácidos nucleicos . 42 (1): 609–621. doi : 10.1093/nar/gkt852. ISSN  0305-1048. PMC 3874169 . PMID  24068553. 
  18. ^ Bonneau, E.; Neveu, B.; Kostantín, E.; Tsongalis, GJ; De Guire, V. (24 de junio de 2019). "¿Qué tan cerca están los miARN de la práctica clínica? Una perspectiva sobre el mercado diagnóstico y terapéutico". EJIFCC . 30 (2): 114-127. ISSN  1650-3414. PMC 6599191 . PMID  31263388. 
  19. ^ Bonetta L (2005). "Horario de máxima audiencia para la PCR en tiempo real". Nat. Métodos . 2 (4): 305–312. doi : 10.1038/nmeth0405-305 . S2CID  17711047.
  20. ^ abc Kubota, Kengo; Ohashi, Akiyoshi; Imachi, Hiroyuki; Harada, Hideki (agosto de 2006). "Eficiencia de hibridación in situ mejorada con sondas de ADN incorporadas con ácido nucleico bloqueado". Microbiología Aplicada y Ambiental . 72 (8): 5311–5317. doi :10.1128/AEM.03039-05. ISSN  0099-2240. PMC 1538721 . PMID  16885281. 
  21. ^ van Ravesteyn, TW; Dekker, M; Pescado, A; Sixma, TK; Wolters, A; Dekker, RJ; Te Riele, HP (12 de abril de 2016). "La modificación con LNA de oligonucleótidos de ADN monocatenario permite una modificación genética sutil en células competentes en reparación de errores de coincidencia". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 113 (15): 4122–7. doi : 10.1073/pnas.1513315113 . PMC 4839440 . PMID  26951689.