Una digestión de restricción es un procedimiento utilizado en biología molecular para preparar ADN para análisis u otro procesamiento. A veces se le denomina fragmentación del ADN , aunque este término también se utiliza para otros procedimientos. En una digestión de restricción, las moléculas de ADN se escinden en sitios de restricción específicos de 4 a 12 nucleótidos de longitud mediante el uso de enzimas de restricción que reconocen estas secuencias. [1]
El ADN digerido resultante suele amplificarse selectivamente mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), lo que lo hace más adecuado para técnicas analíticas como la electroforesis en gel de agarosa y la cromatografía . Se utiliza en huellas genéticas , subclonación de plásmidos y análisis RFLP .
Una enzima de restricción dada corta segmentos de ADN dentro de una secuencia de nucleótidos específica , en lo que se llama un sitio de restricción . Estas secuencias de reconocimiento suelen tener una longitud de cuatro, seis, ocho, diez o doce nucleótidos y generalmente son palindrómicas (es decir, la misma secuencia de nucleótidos en la dirección 5' – 3'). Debido a que hay un número limitado de formas de organizar los cuatro nucleótidos que componen el ADN (adenina, timina, guanina y citosina) en una secuencia de cuatro a doce nucleótidos, las secuencias de reconocimiento tienden a ocurrir por casualidad en cualquier secuencia larga. Se han identificado y sintetizado enzimas de restricción específicas para cientos de secuencias distintas para su venta a los laboratorios y, como resultado, aparecen varios "sitios de restricción" potenciales en casi cualquier gen o locus de interés en cualquier cromosoma. Además, casi todos los plásmidos artificiales incluyen un polienlazador (a menudo completamente sintético) (también llamado "sitio de clonación múltiple") que contiene docenas de secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción dentro de un segmento muy corto de ADN. Esto permite la inserción de casi cualquier fragmento específico de ADN en vectores plasmídicos , que pueden "clonarse" eficientemente mediante su inserción en células bacterianas en replicación.
After restriction digest, DNA can then be analysed using agarose gel electrophoresis. In gel electrophoresis, a sample of DNA is first "loaded" onto a slab of agarose gel (literally pipetted into small wells at one end of the slab). The gel is then subjected to an electric field, which draws the negatively charged DNA across it. The molecules travel at different rates (and therefore end up at different distances) depending on their net charge (more highly charged particles travel further), and size (smaller particles travel further). Since none of the four nucleotide bases carry any charge, net charge becomes insignificant and size is the main factor affecting rate of diffusion through the gel. Net charge in DNA is produced by the sugar-phosphate backbone. This is in contrast to proteins, in which there is no "backbone", and net charge is generated by different combinations and numbers of charged amino acids.
Restriction digest is most commonly used as part of the process of the molecular cloning of DNA fragment into a vector (such as a cloning vector or an expression vector). The vector typically contains a multiple cloning site where many restriction site may be found, and a foreign piece of DNA may be inserted into the vector by first cutting the restriction sites in the vector as well the DNA fragment, followed by ligation of the DNA fragment into the vector.
Restriction digests are also necessary for performing any of the following analytical techniques:
There are numerous types of restriction enzymes, each of which will cut DNA differently. Most commonly used restriction enzymes are Type II restriction endonuclease (See article on Restriction enzymes for examples). There are some that cut a three base pair sequence while others can cut four, six, and even eight. Each enzyme has distinct properties that determine how efficiently it can cut and under what conditions. Most manufacturers that produce such enzymes will often provide a specific buffer solution that contains the unique mix of cations and other components that aid the enzyme in cutting as efficiently as possible. Different restriction enzymes may also have different optimal temperatures under which they function.
Tenga en cuenta que para una digestión eficiente del ADN, el sitio de restricción no debe ubicarse al final de un fragmento de ADN. Las enzimas de restricción pueden requerir un número mínimo de pares de bases entre el sitio de restricción y el extremo del ADN para que la enzima funcione de manera eficiente. [2] Este número puede variar entre enzimas, pero para las enzimas de restricción más utilizadas, alrededor de 6 a 10 pares de bases son suficientes.