Un sitio de clonación múltiple ( MCS ), también llamado polienlazador , es un segmento corto de ADN que contiene muchos sitios de restricción (hasta ~20) , una característica estándar de los plásmidos diseñados . [1] Los sitios de restricción dentro de un MCS son típicamente únicos y aparecen solo una vez dentro de un plásmido determinado. El propósito de un MCS en un plásmido es permitir que un fragmento de ADN se inserte en esa región. [2]
Un MCS se encuentra en una variedad de vectores, incluidos los vectores de clonación para aumentar la cantidad de copias del ADN objetivo y en los vectores de expresión para crear un producto proteico. [3] En los vectores de expresión, el MCS se encuentra aguas abajo del promotor . [2]
En algunos casos, un vector puede no contener un MCS. En su lugar, se puede agregar un MCS a un vector. [4] El primer paso es diseñar secuencias de oligonucleótidos complementarias que contengan sitios de enzimas de restricción junto con bases adicionales en el extremo que sean complementarias al vector después de la digestión. Luego, las secuencias de oligonucleótidos se pueden hibridar y ligar en el vector digerido y purificado. El vector digerido se corta con una enzima de restricción que complementa los salientes del inserto de oligonucleótidos. Después de la ligación, se transforma el vector en bacterias y se verifica el inserto mediante secuenciación. Este método también se puede utilizar para agregar nuevos sitios de restricción a un sitio de clonación múltiple.
Los sitios de clonación múltiples son una característica que permite la inserción de ADN extraño sin alterar el resto del plásmido, lo que lo hace extremadamente útil en biotecnología , bioingeniería y genética molecular . [1] Los MCS pueden ayudar a crear organismos transgénicos, más comúnmente conocidos como organismos genéticamente modificados (OGM) mediante ingeniería genética. Para aprovechar el MCS en la ingeniería genética, se debe agregar un gen de interés al vector durante la producción cuando se corta el MCS. [5] Después de que el MCS se crea y se liga, incluirá el gen de interés y se puede amplificar para aumentar el número de copias del gen en una bacteria huésped. Después de que la bacteria se replica, el gen de interés se puede extraer de la bacteria. En algunos casos, se puede utilizar un vector de expresión para crear un producto proteico. Una vez que se aíslan los productos, tienen una amplia variedad de usos, como la producción de insulina , la creación de vacunas , la producción de antibióticos y la creación de terapias genéticas.
Un plásmido bacteriano utilizado en ingeniería genética como vector de clonación de plásmidos es el pUC18. Su región polienlazadora está compuesta por varios sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, que se han diseñado en un solo grupo (el polienlazador). Tiene sitios de restricción para varias enzimas de restricción, incluidas EcoRI , BamHI y PstI . Otro vector utilizado en ingeniería genética es el pUC19 , que es similar al pUC18, pero su región polienlazadora está invertida. E. coli también se utiliza comúnmente como huésped bacteriano debido a su disponibilidad, rápida tasa de crecimiento y versatilidad. [6] Un ejemplo de un vector de clonación de plásmidos que modifica la proteína insertada es el plásmido pFUSE-Fc.
Para diseñar genéticamente la insulina, el primer paso es cortar el MCS en el plásmido que se va a utilizar. [7] Una vez que se corta el MCS, se puede añadir el gen de la insulina humana para modificar genéticamente el plásmido. Después de eso, el plásmido modificado genéticamente se coloca en el huésped bacteriano y se deja que se divida. Para producir el gran suministro que se necesita, las células huésped se colocan en un gran tanque de fermentación que es un entorno óptimo para el huésped. El proceso finaliza filtrando la insulina del huésped. Luego se puede realizar la purificación para que la insulina pueda envasarse y distribuirse a personas con diabetes.
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