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Ligadura (biología molecular)

Una ligadura con extremo pegajoso

La ligación es la unión de dos nucleótidos, o dos fragmentos de ácido nucleico, en una sola cadena polimérica a través de la acción de una enzima conocida como ligasa . La reacción implica la formación de un enlace fosfodiéster entre el extremo 3'-hidroxilo de un nucleótido y el extremo 5'-fosforilo de otro nucleótido, lo que da como resultado que los dos nucleótidos se unan consecutivamente en una sola cadena. La ligación funciona fundamentalmente de la misma manera tanto para el ADN como para el ARN. Generalmente, en la reacción interviene un cofactor, normalmente ATP o NAD + . Las ligasas eucariotas pertenecen al tipo ATP, mientras que las del tipo NAD+ se encuentran en las bacterias (p. ej., E. coli ). [1]

La ligación ocurre naturalmente como parte de numerosos procesos celulares, incluyendo la replicación, transcripción, empalme y recombinación del ADN, y también es un procedimiento de laboratorio esencial en la clonación molecular , mediante el cual los fragmentos de ADN se unen para crear moléculas de ADN recombinante (como cuando se inserta un fragmento de ADN extraño en un plásmido ). El descubrimiento de la ADN ligasa se remonta a 1967 y fue un evento importante en el campo de la biología molecular . [1] La ligación en el laboratorio normalmente se realiza utilizando la ADN ligasa T4 . Se utiliza ampliamente in vitro debido a su capacidad de unir fragmentos con extremos pegajosos, así como fragmentos con extremos romos. [2] Sin embargo, los procedimientos para la ligación sin el uso de la ADN ligasa estándar también son populares. Las anomalías de la ADN ligasa humana se han relacionado con trastornos patológicos caracterizados por inmunodeficiencia, sensibilidad a la radiación y problemas de desarrollo. [3]

Reacción de ligadura

El mecanismo de la reacción de ligación fue dilucidado por primera vez en el laboratorio de I. Robert Lehman. [4] [5] Dos fragmentos de ADN pueden unirse mediante la ADN ligasa , que cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre el grupo 3'-hidroxilo (-OH) en un extremo de una cadena de ADN y el grupo 5'-fosfato (-PO4) de otra. En animales y bacteriófagos , se utiliza ATP como fuente de energía para la ligación, mientras que en bacterias se utiliza NAD + . [6]

La ADN ligasa reacciona primero con ATP o NAD + , formando un intermediario ligasa-AMP con el AMP unido al grupo ε-amino de la lisina en el sitio activo de la ligasa a través de un enlace fosforamida. Este grupo adenililo se transfiere luego al grupo fosfato en el extremo 5' de una cadena de ADN, formando un complejo ADN-adenilato. Finalmente, se forma un enlace fosfodiéster entre los dos extremos del ADN a través del ataque nucleofílico del 3'-hidroxilo en el extremo de una cadena de ADN sobre el grupo 5'-fosforilo activado de otra. [4]

Una mella en el ADN (es decir, una rotura en una hebra de un ADN bicatenario) puede ser reparada de manera muy eficiente por la ligasa. Sin embargo, una característica complicada de la ligadura se presenta cuando se ligan dos extremos de ADN separados, ya que los dos extremos deben unirse antes de que pueda continuar la reacción de ligadura. En la ligadura de ADN con extremos pegajosos o cohesivos , las hebras salientes de ADN ya pueden estar recocidas juntas, por lo tanto, es un proceso relativamente eficiente ya que es equivalente a reparar dos mellas en el ADN. Sin embargo, en la ligadura de extremos romos , que carecen de extremos salientes para que el ADN se recoja, el proceso depende de una colisión aleatoria para que los extremos se alineen antes de que puedan ligarse y, en consecuencia, es un proceso mucho menos eficiente. [7] La ​​ADN ligasa de E. coli no puede ligar ADN con extremos romos excepto en condiciones de aglomeración molecular y, por lo tanto, normalmente no se usa para la ligadura en el laboratorio. En su lugar, se utiliza la ADN ligasa del fago T4 , ya que puede ligar tanto el ADN de extremos romos como el ADN de cadena sencilla. [8] [6]

Factores que afectan la ligadura

Los factores que afectan a una reacción química mediada por enzimas afectarían naturalmente a una reacción de ligadura, estos incluyen la concentración de enzima y los reactivos, la temperatura de reacción y el tiempo de incubación. La ligadura es complicada por el hecho de que la reacción puede involucrar reacciones intermoleculares e intramoleculares, pero los productos de ligadura deseados en muchas reacciones de ligadura (por ejemplo, ligar un fragmento de ADN en un vector) primero deben ser intermoleculares, es decir, entre dos moléculas de ADN diferentes, seguido de una reacción intramolecular para sellar y circularizar la molécula. Para una ligadura eficiente, también es necesario un paso de hibridación adicional.

Los tres pasos para formar un nuevo enlace fosfodiéster durante la ligadura son: adenililación de la enzima, transferencia de adenililo al ADN y sellado de la muesca. El Mg(2+) es un cofactor para la catálisis, por lo tanto, a alta concentración de Mg(2+) la eficiencia de la ligadura es alta. Si la concentración de Mg(2+) es limitada, el sellado de la muesca es la reacción limitante de la velocidad del proceso, y el intermediario de ADN adenililado permanece en la solución. Tal adenililación de la enzima restringe la unión al intermediario de ADN adenililado en comparación con un talón de Aquiles de LIG1, y representa un riesgo si no se fijan. [9]

Concentración de ADN

La concentración de ADN puede afectar la velocidad de ligadura y si la ligadura es una reacción intermolecular o intramolecular. La ligadura implica unir los extremos de un ADN con otros extremos, sin embargo, cada fragmento de ADN tiene dos extremos y, si los extremos son compatibles, una molécula de ADN puede circularizarse uniendo sus propios extremos. A una alta concentración de ADN, existe una mayor probabilidad de que un extremo de una molécula de ADN se encuentre con el extremo de otra molécula de ADN, formando así una ligadura intermolecular. A una concentración de ADN más baja, la probabilidad de que un extremo de una molécula de ADN se encuentre con el otro extremo de la misma molécula aumenta, por lo tanto, es más probable que se produzca una reacción intramolecular que circularice el ADN. La eficiencia de transformación del ADN lineal también es mucho menor que la del ADN circular y, para que el ADN se circularice, la concentración de ADN no debe ser demasiado alta. Como regla general, la concentración total de ADN debe ser inferior a 10 μg/ml. [10]

La concentración relativa de los fragmentos de ADN, su longitud, así como las condiciones del tampón también son factores que pueden influir en si se favorecen las reacciones intermoleculares o intramoleculares.

La concentración de ADN se puede aumentar artificialmente añadiendo agentes de condensación como hexamina de cobalto y poliaminas biógenas como la espermidina , o utilizando agentes de aglomeración como el polietilenglicol (PEG) que también aumentan la concentración efectiva de enzimas. [11] [12] Sin embargo, hay que tener en cuenta que los aditivos como la hexamina de cobalto pueden producir una reacción exclusivamente intermolecular, [11] dando como resultado concatémeros lineales en lugar del ADN circular más adecuado para la transformación del ADN plasmídico, y por tanto no es deseable para la ligadura de plásmidos. Si es necesario utilizar aditivos en la ligadura de plásmidos, es preferible el uso de PEG, ya que puede promover la ligadura intramolecular así como la intermolecular. [13]

Concentración de ligasa

Como es habitual en el caso de una enzima, cuanto mayor sea la concentración de ligasa, más rápida será la velocidad de ligación. La ligación de extremos romos es mucho menos eficiente que la ligación de extremos pegajosos, por lo que se utiliza una mayor concentración de ligasa en las ligaduras de extremos romos. Se puede utilizar una concentración alta de ADN ligasa junto con PEG para una ligación más rápida, y son los componentes que se encuentran a menudo en los kits comerciales diseñados para una ligación rápida. [14] [15]

Temperatura

Dos cuestiones están involucradas cuando se considera la temperatura de una reacción de ligadura. Primero, la temperatura óptima para la actividad de la ADN ligasa que es 37 ° C, y segundo, la temperatura de fusión (T m ) de los extremos del ADN que se van a ligar. La temperatura de fusión depende de la longitud y la composición de bases del saliente del ADN: cuanto mayor sea el número de G y C, mayor será la T m ya que hay tres enlaces de hidrógeno formados entre el par de bases GC en comparación con dos para el par de bases AT, con alguna contribución del apilamiento de las bases entre fragmentos. Para que la reacción de ligadura se lleve a cabo de manera eficiente, los extremos deben estar recocidos de manera estable y, en los experimentos de ligadura, la T m de los extremos del ADN es generalmente mucho menor que 37 ° C. La temperatura óptima para ligar extremos cohesivos es, por lo tanto, un compromiso entre la mejor temperatura para la actividad de la ADN ligasa y la T m en la que los extremos pueden asociarse. [16] Sin embargo, diferentes enzimas de restricción generan diferentes extremos, y la composición base de los extremos producidos por estas enzimas también puede diferir, la temperatura de fusión y por lo tanto la temperatura óptima pueden variar ampliamente dependiendo de las enzimas de restricción utilizadas, y la temperatura óptima para la ligadura puede estar entre 4-15 ° C dependiendo de los extremos. [17] [18] Las ligaduras también implican a menudo la ligadura de extremos generados a partir de diferentes enzimas de restricción en la misma mezcla de reacción, por lo tanto, puede no ser práctico seleccionar la temperatura óptima para una reacción de ligadura en particular y la mayoría de los protocolos simplemente eligen 12-16 ° C, temperatura ambiente o 4 ° C. Cuando se realiza una ligadura a 4 ° C, es necesario aumentar el tiempo de reacción de ligadura, por ejemplo, dejando la mezcla de ligadura durante la noche o más tiempo en el refrigerador.

Composición del tampón

La fuerza iónica del tampón utilizado puede afectar la ligación. Los tipos de cationes presentes también pueden influir en la reacción de ligación; por ejemplo, una cantidad excesiva de Na + puede hacer que el ADN se vuelva más rígido y aumente la probabilidad de ligación intermolecular. A una concentración alta de catión monovalente (>200 mM), la ligación también puede inhibirse casi por completo. [19] El tampón estándar utilizado para la ligación está diseñado para minimizar los efectos iónicos. [20]

Ligadura de extremos pegajosos

Las enzimas de restricción pueden generar una amplia variedad de extremos en el ADN que digieren, pero en los experimentos de clonación las enzimas de restricción más comúnmente utilizadas generan un saliente monocatenario de 4 bases llamado extremo pegajoso o cohesivo (las excepciones incluyen Nde I que genera un saliente de 2 bases, y aquellos que generan extremos romos). Estos extremos pegajosos pueden aparearse con otros extremos compatibles y ligarse en una ligadura de extremo pegajoso (o extremo cohesivo). Eco RI, por ejemplo, genera un extremo AATT, y dado que A y T tienen una temperatura de fusión más baja que C y G, su temperatura de fusión T m es baja, alrededor de 6 ° C. [21] Para la mayoría de las enzimas de restricción, los salientes generados tienen una T m que está alrededor de 15 ° C. [20] Para fines prácticos, las ligaduras de extremos pegajosos se realizan a 12-16 ° C, o a temperatura ambiente, o alternativamente a 4 ° C durante un período más largo.

Para la inserción de un fragmento de ADN en un vector plasmídico, es preferible utilizar dos enzimas de restricción diferentes para digerir el ADN de manera que se generen extremos diferentes. Los dos extremos diferentes pueden evitar la religación del vector sin ningún inserto y también permiten que el fragmento se inserte de manera direccional.

Cuando no es posible utilizar dos sitios diferentes, puede ser necesario desfosforilar el ADN del vector para evitar un fondo elevado de ADN del vector recircularizado sin inserto. Sin un grupo fosfato en los extremos, el vector no puede ligarse a sí mismo, pero puede ligarse a un inserto con un grupo fosfato. La desfosforilación se realiza habitualmente utilizando fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIAP), que elimina el grupo fosfato del extremo 5′ del ADN digerido, pero tenga en cuenta que la CIAP no es fácil de inactivar y puede interferir con la ligadura sin un paso adicional para eliminar la CIAP, lo que da como resultado el fracaso de la ligadura. La CIAP no debe utilizarse en cantidades excesivas y solo debe utilizarse cuando sea necesario. La fosfatasa alcalina de camarón (SAP) o la fosfatasa antártica (AP) son alternativas adecuadas, ya que se pueden inactivar fácilmente.

Ligadura de extremos romos

La ligadura de extremos romos no implica el apareamiento de bases de los extremos salientes, por lo que cualquier extremo romo puede ligarse a otro extremo romo. Los extremos romos pueden generarse mediante enzimas de restricción como SmaI y Eco RV . Una ventaja importante de la clonación de extremos romos es que el inserto deseado no requiere ningún sitio de restricción en su secuencia, ya que los extremos romos se generan habitualmente en una PCR , y el fragmento de ADN de extremos romos generado por PCR puede luego ligarse en un vector de extremos romos generado a partir de la digestión de restricción.

Sin embargo, la ligadura de extremos romos es mucho menos eficiente que la ligadura de extremos pegajosos; por lo general, la reacción es 100 veces más lenta que la ligadura de extremos pegajosos. Dado que los extremos romos no tienen extremos salientes, la reacción de ligadura depende de colisiones aleatorias entre los extremos romos y, en consecuencia, es mucho menos eficiente. Para compensar la menor eficiencia, la concentración de ligasa utilizada es mayor que la de la ligadura de extremos pegajosos (10 veces o más). La concentración de ADN utilizada en la ligadura de extremos romos también es mayor para aumentar la probabilidad de colisiones entre extremos, y también se puede utilizar un tiempo de incubación más prolongado para las ligaduras de extremos romos.

Si ambos extremos que se deben ligar en un vector son romos, entonces el vector necesita ser desfosforilado para minimizar la autoligación. Esto se puede hacer usando CIAP, pero es necesario tener cuidado en su uso como se señaló anteriormente. Dado que el vector ha sido desfosforilado y la ligación requiere la presencia de un fosfato 5', el inserto debe ser fosforilado. El producto de PCR con extremos romos normalmente carece de un fosfato 5', por lo tanto necesita ser fosforilado mediante tratamiento con polinucleótido quinasa T4 . [22]

La ligadura de extremos romos también se inhibe reversiblemente por una alta concentración de ATP. [23]

La PCR generalmente genera productos de PCR con extremos romos, pero tenga en cuenta que la PCR con polimerasa Taq puede agregar una adenina (A) adicional al extremo 3' del producto de PCR. Esta propiedad se puede aprovechar en la clonación TA , donde los extremos del producto de PCR pueden anexarse ​​al extremo T de un vector. Por lo tanto, la ligadura TA es una forma de ligadura de extremos pegajosos. Los vectores con extremos romos se pueden convertir en vectores para la ligadura TA con trifosfato de didesoxitimidina (ddTTP) utilizando transferasa terminal.

Pautas generales

Para la clonación de un inserto en un plásmido circular:

Solución de problemas

A veces la ligadura no produce los productos ligados deseados y algunas de las posibles razones pueden ser:

Otros métodos de ligadura de ADN

Existen varios kits de clonación de ADN disponibles comercialmente que utilizan otros métodos de ligación que no requieren el uso de las ligasas de ADN habituales. Estos métodos permiten realizar la clonación mucho más rápidamente, además de permitir una transferencia más sencilla del inserto de ADN clonado a diferentes vectores . Sin embargo, estos métodos requieren el uso de vectores y componentes especialmente diseñados y pueden carecer de flexibilidad.

Ligadura mediada por topoisomerasa

Se puede utilizar topoisomerasa en lugar de ligasa para la ligación, y la clonación se puede realizar más rápidamente sin necesidad de digestión por restricción del vector o inserto. En este método de clonación TOPO, se activa un vector linealizado uniendo topoisomerasa I a sus extremos, y este vector "activado por TOPO" puede entonces aceptar un producto de PCR al ligarse a ambos extremos 5' del producto de PCR, la topoisomerasa se libera y se forma un vector circular en el proceso. [28]

Recombinación homóloga

Otro método de clonación sin el uso de ligasa es mediante recombinación de ADN , por ejemplo, como se utiliza en el sistema de clonación Gateway . [29] [30] El gen, una vez clonado en el vector de clonación (llamado clon de entrada en este método), puede introducirse convenientemente en una variedad de vectores de expresión mediante recombinación. [31]

Ejemplos y aplicaciones de las ligasas de ADN

Se han encontrado diferentes tipos de ligasas en los organismos estudiados. Por ejemplo, la ligasa dependiente de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) se encontró y aisló de un organismo bacteriano, conocido como E. coli , en el segundo tercio del siglo XX. Desde entonces, este modelo se ha utilizado ampliamente para estudiar esa familia de ligasas de ADN. Además, se encuentra en todas las bacterias. Ejemplos de genes presentes en E. coli son LigA, que tiene funciones esenciales que afectan al crecimiento bacteriano, y LigB. [32]

En los mamíferos, incluidos los humanos, se identificaron 3 genes, a saber, Lig1, Lig3, Lig4. Todos los eucariotas contienen múltiples tipos de ligasas de ADN codificadas por genes Lig. [33] La ligasa eucariota más pequeña conocida es la ligasa de ADN del virus Chlorella (ChVLig). Contiene solo 298 aminoácidos. Cuando ChVLig es la única fuente de ligasa en la célula, puede continuar apoyando el desarrollo mitótico y la unión de extremos no homólogos en levaduras en ciernes. [34] La ADN ligasa I (Lig1) es responsable de la ligación de fragmentos de Okazaki. Consta de 919 aminoácidos. En un proceso complejo de replicación de ADN, la ADN ligasa I se recluta en la maquinaria de replicación mediante interacciones de proteínas. Lig1 juega un papel en la división celular en plantas y levaduras. La eliminación del gen Lig1 es letal en levaduras y algunos brotes de plantas. Sin embargo, estudios de embriogénesis en ratones han demostrado que hasta la mitad del proceso de crecimiento el embrión se desarrolla sin ADN ligasa I. [35]

La ligación enzimática se ha utilizado en varios estudios relacionados con las nanoestructuras de ADN y ha permitido aumentar la eficiencia y la estabilidad. Uno de los métodos es el sellado de enlaces covalentes de ADN, es decir, enlaces fosfodiéster y mellas. La reconstrucción de esas estructuras se realiza con la ayuda de la ligación. Por ejemplo, la ADN ligasa T4 sirve como catalizador para sellar una mella entre los extremos 3 y 5 principales del ADN para formar un fuerte enlace fosfodiéster. Las estructuras ligadas tienen valores de estabilidad térmica más altos. [36] La ADN ligasa T4 tiene muchas propiedades valiosas, como la catalítica ya mencionada, pero también es responsable del sellado de los huecos entre las cadenas de ADN, la actividad de cierre de mellas, la reparación del daño del ADN, etc. [2]

En la arquitectura de nanoestructuras, las investigaciones de biología molecular - el ssDNA es un modelo de aplicación importante. La ADN ligasa T4 se utiliza para ciclar fragmentos cortos de ssDNA, pero el proceso se complica por la formación de estructuras secundarias. Por otro lado, la ADN ligasa Taq es una enzima termoestable que se puede aplicar a temperaturas más altas (45, 55 y 65 °C respectivamente). Dado que en este rango de temperatura las estructuras secundarias son menos estables, se mejora la eficiencia de ciclización de los oligonucleótidos. Los parámetros cinéticos, biológicos y otros de las nanoestructuras se ven influenciados por la presencia de las estructuras secundarias en los anillos de ADN. Sin embargo, la ligación de ADN Taq ocurre solo cuando dos cadenas de ADN complementarias están perfectamente emparejadas y no tienen espacios entre ellas. [37]

Análisis de las actividades de las ligasas, mutaciones, deficiencias ampliamente utilizadas en el diseño de fármacos e investigaciones biológicas para investigar enfermedades, desarrollos de patologías y síndromes hereditarios o adquiridos raros relacionados (por ejemplo, síndrome de la ADN ligasa IV). [38] [39] [40] [41]

El procedimiento de ligadura es frecuente en las técnicas de clonación de biología molecular y se ha aplicado para definir y caracterizar secuencias de nucleótidos específicas en el genoma utilizando la reacción en cadena de la ligasa (LCR) o la amplificación basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de sondas ligadas. [42]

Análisis

La ligadura también puede servir como método de análisis de ADN . [43] Algunas técnicas emplean la amplificación por círculo rodante . [43] La más notable de ellas es descrita por Smolina et al. , 2007 y Smolina et al. , 2008 utilizando hibridación in situ de fluorescencia y ácidos nucleicos peptídicos . [43] Desarrollaron y emplearon esta técnica para análisis de cromosomas bacterianos. [43]

Véase también

Referencias

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