La clonación basada en topoisomerasa (clonación TOPO) es una técnica de biología molecular en la que los fragmentos de ADN se clonan en vectores específicos sin necesidad de ligasas de ADN . La polimerasa Taq tiene una actividad de transferasa terminal no dependiente de la plantilla que añade una única desoxiadenosina (A) al extremo 3' de los productos de PCR. Esta característica se aprovecha en la clonación TOPO TA de "extremos pegajosos". [1] En la clonación TOPO de "extremos romos", el vector receptor no tiene salientes y se pueden clonar fragmentos de ADN de extremos romos.
La técnica utiliza la actividad biológica inherente de la topoisomerasa I del ADN. El papel biológico de la topoisomerasa es cortar y volver a unir los extremos superenrollados del ADN para facilitar la replicación. La topoisomerasa I del virus vaccinia reconoce específicamente la secuencia de ADN 5'-(C/T)CCTT-3'. Durante la replicación , la enzima digiere el ADN específicamente en esta secuencia, desenrolla el ADN y lo vuelve a ligar en el grupo fosfato 3' de la base de timidina . [1]
Los vectores de los kits TOPO disponibles comercialmente se han añadido al sitio de la topoisomerasa incrustado en un casete de beta-galactosidasa que permite el barrido azul-blanco. De este modo, los extremos del vector se autoensamblan, lo que da lugar a la producción de colonias azules que no necesitan ser seleccionadas ni secuenciadas para obtener clones positivos potenciales.
Los vectores TOPO están diseñados de tal manera que llevan esta secuencia específica 5'-(C/T)CCTT-3' en los dos extremos lineales. El ADN del vector lineal ya tiene la enzima topoisomerasa unida covalentemente a los extremos 3' libres de ambas hebras. Luego, esta enzima se mezcla con los productos de PCR. Cuando los extremos 5' libres de las hebras del producto de PCR se unen al extremo 3' de la topoisomerasa de cada hebra del vector, las hebras se unen covalentemente mediante la topoisomerasa ya unida. Esta reacción se lleva a cabo de manera eficiente cuando esta solución se incuba a temperatura ambiente con la sal requerida. Se utilizan diferentes tipos de vectores para clonar fragmentos amplificados por la polimerasa Taq o Pfu, ya que la polimerasa Taq (a diferencia de Pfu) deja un nucleótido "A" adicional en el extremo 3' durante la amplificación. [1]
La técnica de clonación TA TOPO se basa en la capacidad de la adenina (A) y la timina (T) (pares de bases complementarios) en diferentes fragmentos de ADN para hibridar y, en presencia de ligasa o topoisomerasa, ligarse entre sí. El inserto se crea mediante PCR utilizando la ADN polimerasa Taq, una polimerasa que carece de actividad de corrección de errores de 3' a 5' y que con una alta probabilidad agrega un solo saliente de adenina 3' a cada extremo del producto de PCR. Es mejor si los cebadores de PCR tienen guaninas en el extremo 5' ya que esto maximiza la probabilidad de que la ADN polimerasa Taq agregue el saliente de adenosina terminal. No se deben utilizar polimerasas termoestables que contengan una amplia actividad de exonucleasa 3' a 5' ya que no dejan los salientes de adenina 3'. El vector objetivo se linealiza y se corta con una enzima de restricción de extremos romos. Luego, este vector se ata con trifosfato de didesoxitimidina (ddTTP) utilizando transferasa terminal. Es importante utilizar ddTTP para garantizar la adición de un solo residuo T. Esta cola deja al vector con un solo residuo de timina que sobresale 3' en cada extremo romo. [1]
También se pueden utilizar polimerasas (como Phusion) o enzimas de restricción que producen extremos romos para la clonación TOPO. En lugar de depender de extremos pegajosos, el vector TOPO de extremos romos tiene extremos romos donde se unen las moléculas de topoisomerasa. Hay disponibles kits comerciales, como el kit de clonación Zero Blunt® de Invitrogen. [2]