La Taq polimerasa es una ADN polimerasa termoestable que lleva el nombre delmicroorganismo eubacteriano termófilo Thermus Aquaticus , del cual fue aislada originalmente por Chien et al. en 1976. [1] Su nombre a menudo se abrevia como Taq o Taq pol . Se utiliza frecuentemente en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un método para amplificar enormemente la cantidad de segmentos cortos de ADN .
T. Aquaticus es una bacteria que vive en aguas termales y respiraderos hidrotermales , y la Taq polimerasa fue identificada [1] como una enzima capaz de resistir las condiciones de desnaturalización de proteínas (alta temperatura) requeridas durante la PCR. [2] Por lo tanto, reemplazó la ADN polimerasa de E. coli utilizada originalmente en la PCR. [3]
La temperatura óptima de actividad de Taq es de 75 a 80 °C, con una vida media superior a 2 horas a 92,5 °C, 40 minutos a 95 °C y 9 minutos a 97,5 °C, y puede replicar un par de 1000 bases. hebra de ADN en menos de 10 segundos a 72 °C. [4] A 75-80 °C, Taq alcanza su velocidad de polimerización óptima de aproximadamente 150 nucleótidos por segundo por molécula de enzima, y cualquier desviación del rango de temperatura óptimo inhibe la velocidad de extensión de la enzima. Un solo Taq sintetiza alrededor de 60 nucleótidos por segundo a 70 °C, 24 nucleótidos/s a 55 °C, 1,5 nucleótidos/s a 37 °C y 0,25 nucleótidos/s a 22 °C. A temperaturas superiores a 90 °C, Taq demuestra muy poca o ninguna actividad, pero la enzima en sí no se desnaturaliza y permanece intacta. [5] La presencia de ciertos iones en el recipiente de reacción también afecta la actividad específica de la enzima. Pequeñas cantidades de cloruro de potasio (KCl) y iones de magnesio (Mg 2+ ) promueven la actividad enzimática de Taq . La polimerasa Taq se activa al máximo con KCl 50 mM y la concentración justa de Mg 2+ , que está determinada por la concentración de nucleósidos trifosfato (dNTP). Altas concentraciones de KCl y Mg 2+ inhiben la actividad de Taq . [6] Curiosamente, el quelante de iones metálicos común, EDTA , se une directamente a Taq en ausencia de estos iones metálicos. [7]
Uno de los inconvenientes de Taq es su falta de actividad correctora de exonucleasas 3' a 5' [4], lo que da como resultado una fidelidad de replicación relativamente baja. Originalmente, su tasa de error se midió en aproximadamente 1 en 9.000 nucleótidos. [8] Algunas ADN polimerasas termoestables se han aislado de otras bacterias y arqueas termófilas, como la ADN polimerasa Pfu , que posee una actividad correctora, y se están utilizando en lugar de (o en combinación con) Taq para amplificación de alta fidelidad. [9] La fidelidad puede variar mucho entre Taqs, lo que tiene efectos profundos en las aplicaciones de secuenciación posteriores. [10]
Taq fabrica productos de ADN que tienen salientes A ( adenina ) en sus extremos 3'. Esto puede ser útil en la clonación TA , mediante la cual se utiliza un vector de clonación (tal como un plásmido ) que tiene un saliente 3' T ( timina ), que se complementa con el saliente A del producto de la PCR, permitiendo así la ligación del producto de la PCR en el vector plásmido.
A principios de la década de 1980, Kary Mullis trabajaba en Cetus Corporation en la aplicación de ADN sintético a la biotecnología . Estaba familiarizado con el uso de oligonucleótidos de ADN como sondas para unirse a cadenas de ADN diana, así como con su uso como cebadores para la secuenciación de ADN y la síntesis de ADNc . En 1983, comenzó a utilizar dos cebadores, uno para hibridar con cada hebra de un ADN objetivo, y añadió ADN polimerasa a la reacción. Esto condujo a una replicación exponencial del ADN , [11] amplificando en gran medida segmentos discretos de ADN entre los cebadores. [3]
Sin embargo, después de cada ronda de replicación, la mezcla debe calentarse a más de 90 °C para desnaturalizar el ADN recién formado, permitiendo que las cadenas se separen y actúen como plantillas en la siguiente ronda de amplificación. Este paso de calentamiento también inactiva la ADN polimerasa que estaba en uso antes del descubrimiento de la Taq polimerasa, el fragmento Klenow (procedente de E. coli ). La polimerasa Taq es muy adecuada para esta aplicación porque es capaz de soportar la temperatura de 95 °C necesaria para la separación de las cadenas de ADN sin desnaturalizarse.
El uso del Taq termoestable permite ejecutar la PCR a alta temperatura (~60 °C y más), lo que facilita una alta especificidad de los cebadores y reduce la producción de productos no específicos, como el dímero de cebador . Además, el uso de una polimerasa termoestable elimina la necesidad de agregar una nueva enzima a cada ronda de termociclado. Se puede utilizar un único tubo cerrado en una máquina relativamente sencilla para llevar a cabo todo el proceso. Así, el uso de la polimerasa Taq fue la idea clave que hizo que la PCR fuera aplicable a una gran variedad de problemas de biología molecular relacionados con el análisis de ADN. [2]
Hoffmann-La Roche finalmente compró las patentes PCR y Taq de Cetus por 330 millones de dólares, de los cuales pudo haber recibido hasta 2 mil millones de dólares en regalías. [12] En 1989, la revista Science nombró a la Taq polimerasa su primera " Molécula del año ". Kary Mullis recibió el Premio Nobel de Química en 1993, el único otorgado por una investigación realizada en una empresa de biotecnología . A principios de la década de 1990, la técnica de PCR con Taq polimerasa se utilizaba en muchas áreas, incluida la investigación de biología molecular básica, las pruebas clínicas y la ciencia forense . También empezó a encontrar una aplicación acuciante en la detección directa del VIH en el SIDA . [13]
En diciembre de 1999, el juez de distrito estadounidense Vaughn Walker dictaminó que la patente de 1990 relacionada con la polimerasa Taq se emitió, en parte, sobre la base de información engañosa y afirmaciones falsas de científicos de Cetus Corporation . El fallo apoyó una impugnación de Promega Corporation contra Hoffman-La Roche , que compró las patentes de Taq en 1991. El juez Walker citó descubrimientos previos de otros laboratorios, incluido el laboratorio del profesor John Trela en el departamento de ciencias biológicas de la Universidad de Cincinnati , como la base para el fallo. [14]
Taq Pol A tiene una estructura general similar a la de E. coli PolA. El dominio exonucleasa medio 3'-5' responsable de la corrección ha cambiado drásticamente y no es funcional. [15] Tiene un dominio exonucleasa 5'-3' funcional en el amino terminal, que se describe a continuación. Los dos dominios restantes actúan en coordinación, mediante movimiento de dominio acoplado. [dieciséis]
La exonucleasa Taq polimerasa es un dominio que se encuentra en el extremo amino de la Taq ADN polimerasa I (termoestable). Asume un motivo similar a la ribonucleasa H. El dominio confiere actividad exonucleasa 5'- 3' a la polimerasa. [17]
A diferencia del mismo dominio en E. coli , que degradaría los cebadores y debe eliminarse mediante digestión para su uso en PCR, [9] no se dice que este dominio degrade el cebador. [18] Esta actividad se utiliza en la sonda TaqMan : a medida que se forman las hebras hijas, las sondas complementarias a la plantilla entran en contacto con la polimerasa y se escinden en piezas fluorescentes. [19]
La Taq polimerasa está unida en su hendidura del sitio activo de la polimerasa con el extremo romo del ADN dúplex. Como la Taq polimerasa está en contacto con el ADN unido, sus cadenas laterales forman enlaces de hidrógeno con las purinas y pirimidinas del ADN. La misma región de la Taq polimerasa que se ha unido al ADN también se une a la exonucleasa. Estas estructuras unidas a la Taq polimerasa tienen diferentes interacciones.
Se ha informado de un experimento de mutagénesis dirigida al sitio que mejora la actividad residual de la exonucleasa 3'-5' en un factor de 2, pero nunca se informó si hacerlo disminuye la tasa de error. [20] Siguiendo una línea de pensamiento similar, las proteínas quimeras se han elaborado seleccionando dominios de E. coli , Taq y T. neapolitana polimerasa I. Al intercambiar el dominio vestigial por uno funcional de E. coli se creó una proteína. con capacidad de corrección de pruebas pero una temperatura óptima más baja y baja termoestabilidad. [21]
Se han producido versiones de la polimerasa sin el dominio exonucleasa 5'-3', entre las que son más conocidas Klentaq o el fragmento Stoffel . La falta total de actividad exonucleasa hace que estas variantes sean adecuadas para cebadores que exhiben una estructura secundaria, así como para copiar moléculas circulares. [9] Otras variaciones incluyen el uso de Klentaq con una polimerasa de alta fidelidad, una termosequenasa que reconoce sustratos como lo hace la ADN polimerasa T7 , mutantes con mayor tolerancia a los inhibidores o versiones "etiquetadas con dominio" que tienen un motivo de hélice-horquilla-hélice adicional. alrededor del sitio catalítico para sujetar el ADN con más fuerza a pesar de las condiciones adversas. [22]
Debido a las mejoras que la Taq polimerasa proporcionó en la replicación del ADN por PCR: mayor especificidad, menos productos no específicos y procesos y equipos más simples, ha sido fundamental en los esfuerzos realizados para detectar enfermedades. "El uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en el diagnóstico de enfermedades infecciosas ha dado como resultado la capacidad de diagnosticar tempranamente y tratar adecuadamente enfermedades debidas a patógenos exigentes, determinar la susceptibilidad a los antimicrobianos de organismos de crecimiento lento y determinar la magnitud de la infección". [23] La implementación de la Taq polimerasa ha salvado innumerables vidas. Ha desempeñado un papel esencial en la detección de muchas de las peores enfermedades del mundo, entre ellas: tuberculosis, faringitis estreptocócica, neumonía atípica, SIDA, sarampión, hepatitis e infecciones urogenitales ulcerosas. La PCR, el método utilizado para recrear copias de muestras de ADN específicas, hace posible la detección de enfermedades al apuntar a una secuencia de ADN específica de un patógeno objetivo de la muestra de un paciente y amplificar trazas de las secuencias indicativas copiándolas hasta miles de millones de veces. Aunque este es el método más preciso de detección de enfermedades, especialmente para el VIH, no se realiza con tanta frecuencia como pruebas alternativas e inferiores debido al costo, la mano de obra y el tiempo relativamente altos que requieren. [24]
La dependencia de la polimerasa Taq como catalizador para el proceso de replicación de la PCR se destacó durante la pandemia de COVID-19 de 2020. La escasez de la enzima necesaria ha afectado la capacidad de los países de todo el mundo para producir kits de prueba para el virus. Sin la Taq polimerasa, el proceso de detección de enfermedades es mucho más lento y tedioso. [25]
A pesar de las ventajas de utilizar la Taq polimerasa en la detección de enfermedades por PCR, la enzima no está exenta de desventajas. Las enfermedades retrovirales (VIH, HTLV-1 y HTLV-II) suelen incluir mutaciones de guanina a adenina en su genoma. Mutaciones como estas son las que permiten que las pruebas de PCR detecten enfermedades, pero la tasa de fidelidad relativamente baja de la polimerasa Taq hace que ocurra la misma mutación G a A y posiblemente produzca un resultado de prueba falso positivo. [26]
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