La termodinámica de los ácidos nucleicos es el estudio de cómo la temperatura afecta la estructura del ácido nucleico del ADN bicatenario (ADNbc). La temperatura de fusión ( Tm ) se define como la temperatura a la que la mitad de las cadenas de ADN están en estado de espiral aleatoria o monocatenaria (ADNss). Tm depende de la longitud de la molécula de ADN y de su secuencia de nucleótidos específica . Se dice que el ADN, cuando se encuentra en un estado en el que sus dos hebras están disociadas (es decir, la molécula de ADNbc existe como dos hebras independientes), ha sido desnaturalizado por la alta temperatura.
La hibridación es el proceso de establecer una interacción no covalente , específica de secuencia, entre dos o más hebras complementarias de ácidos nucleicos en un único complejo, que en el caso de dos hebras se denomina dúplex . Los oligonucleótidos , el ADN o el ARN se unirán a su complemento en condiciones normales, por lo que dos cadenas perfectamente complementarias se unirán fácilmente entre sí. Para reducir la diversidad y obtener los complejos energéticamente más preferidos, en la práctica de laboratorio se utiliza una técnica llamada recocido . Sin embargo, debido a las diferentes geometrías moleculares de los nucleótidos, una única inconsistencia entre las dos cadenas hará que la unión entre ellas sea menos favorable desde el punto de vista energético. Medir los efectos de la incompatibilidad de bases cuantificando la temperatura a la que se hibridan dos hebras puede proporcionar información sobre la similitud en la secuencia de bases entre las dos hebras que se hibridan. Los complejos pueden disociarse mediante desnaturalización térmica , también denominada fusión. En ausencia de factores negativos externos, los procesos de hibridación y fusión pueden repetirse sucesivamente indefinidamente, lo que sienta las bases para la reacción en cadena de la polimerasa . Lo más común es que se formen los pares de bases nucleicas A=T y G≡C, de las cuales la última es más estable.
La desnaturalización del ADN , también llamada fusión del ADN, es el proceso mediante el cual el ácido desoxirribonucleico bicatenario se desenrolla y se separa en hebras monocatenarias mediante la ruptura de las atracciones de apilamiento hidrofóbicas entre las bases. Ver efecto hidrofóbico . Ambos términos se utilizan para referirse al proceso que ocurre cuando se calienta una mezcla, aunque "desnaturalización" también puede referirse a la separación de cadenas de ADN inducida por sustancias químicas como formamida o urea . [1]
El proceso de desnaturalización del ADN se puede utilizar para analizar algunos aspectos del ADN. Debido a que el emparejamiento de bases citosina/guanina es generalmente más fuerte que el emparejamiento de bases adenina/timina, la cantidad de citosina y guanina en un genoma se denomina contenido de GC y puede estimarse midiendo la temperatura a la que se funde el ADN genómico. [2] Las temperaturas más altas están asociadas con un alto contenido de GC.
La desnaturalización del ADN también se puede utilizar para detectar diferencias de secuencia entre dos secuencias de ADN diferentes. El ADN se calienta y se desnaturaliza hasta alcanzar un estado monocatenario y la mezcla se enfría para permitir que las hebras se rehibriden. Las moléculas híbridas se forman entre secuencias similares y cualquier diferencia entre esas secuencias dará como resultado una interrupción del emparejamiento de bases. A escala genómica, el método ha sido utilizado por investigadores para estimar la distancia genética entre dos especies, un proceso conocido como hibridación ADN-ADN . [3] En el contexto de una única región aislada de ADN, se pueden utilizar geles de gradiente desnaturalizante y geles de gradiente de temperatura para detectar la presencia de pequeños desajustes entre dos secuencias, un proceso conocido como electroforesis en gel de gradiente de temperatura . [4] [5]
Los métodos de análisis de ADN basados en la temperatura de fusión tienen la desventaja de ser sustitutos para estudiar la secuencia subyacente; La secuenciación de ADN generalmente se considera un método más preciso.
El proceso de fusión del ADN también se utiliza en técnicas de biología molecular, en particular en la reacción en cadena de la polimerasa . Aunque la temperatura de fusión del ADN no es diagnóstica en la técnica, los métodos para estimar la Tm son importantes para determinar las temperaturas adecuadas a utilizar en un protocolo. Las temperaturas de fusión del ADN también se pueden utilizar como indicador para igualar las fuerzas de hibridación de un conjunto de moléculas, por ejemplo, las sondas de oligonucleótidos de micromatrices de ADN .
Recocido, en genética , significa que secuencias complementarias de ADN o ARN monocatenario se emparejan mediante enlaces de hidrógeno para formar un polinucleótido bicatenario . Antes de que pueda ocurrir el recocido, es posible que sea necesario fosforilar una de las hebras mediante una enzima como la quinasa para permitir que se produzcan enlaces de hidrógeno adecuados. El término hibridación se utiliza a menudo para describir la unión de una sonda de ADN o la unión de un cebador a una cadena de ADN durante una reacción en cadena de la polimerasa . El término también se usa a menudo para describir la reformación ( renaturalización ) de hebras complementarias inversas que fueron separadas por calor (desnaturalizadas térmicamente). Proteínas como RAD52 pueden ayudar a la hibridación del ADN. El recocido de cadenas de ADN es un paso clave en las vías de recombinación homóloga . En particular, durante la meiosis , la hibridación de cadenas dependiente de la síntesis es una vía importante de recombinación homóloga.
El apilamiento es la interacción estabilizadora entre las superficies planas de bases adyacentes. El apilamiento puede realizarse con cualquier cara de la base, es decir, 5'-5', 3'-3' y viceversa. [7]
El apilamiento de las moléculas de ácido nucleico "libres" se debe principalmente a la fuerza intermolecular , específicamente a la atracción electrostática entre anillos aromáticos, un proceso también conocido como apilamiento pi . Para sistemas biológicos con agua como solvente, el efecto hidrofóbico contribuye y ayuda a la formación de una hélice. [8] El apilamiento es el principal factor estabilizador en la doble hélice del ADN. [9]
La contribución del apilamiento a la energía libre de la molécula se puede estimar experimentalmente observando el equilibrio del apilamiento doblado en el ADN mellado . Esta estabilización depende de la secuencia. [6] El grado de estabilización varía según las concentraciones de sal y la temperatura. [9]
Se utilizan varias fórmulas para calcular los valores de Tm . [10] [11] Algunas fórmulas son más precisas para predecir las temperaturas de fusión de los dúplex de ADN. [12] Para los oligonucleótidos de ADN, es decir, secuencias cortas de ADN, la termodinámica de la hibridación puede describirse con precisión como un proceso de dos estados. En esta aproximación se desprecia la posibilidad de estados de unión parciales intermedios en la formación de un estado bicatenario a partir de dos oligonucleótidos monocatenarios. Bajo esta suposición se pueden describir elegantemente los parámetros termodinámicos para formar el ácido nucleico bicatenario AB a partir de los ácidos nucleicos monocatenarios A y B.
La constante de equilibrio para esta reacción es . Según la ecuación de Van´t Hoff, la relación entre la energía libre, Δ G y K es Δ G° = - RT ln K , donde R es la constante de la ley de los gases ideales y T es la temperatura Kelvin de la reacción. Esto da, para el sistema de ácido nucleico,
.
La temperatura de fusión, Tm , se produce cuando la mitad del ácido nucleico bicatenario se ha disociado. Si no hay ácidos nucleicos adicionales presentes, entonces [A], [B] y [AB] serán iguales e igual a la mitad de la concentración inicial de ácido nucleico bicatenario, [AB] inicial . Esto da una expresión para el punto de fusión de un ácido nucleico dúplex de
.
Debido a que Δ G ° = Δ H ° - T Δ S °, T m también viene dada por
.
Los términos Δ H ° y Δ S ° generalmente se dan para la reacción de asociación y no para la disociación (consulte el método del vecino más cercano, por ejemplo). Esta fórmula luego se convierte en: [13]
, donde [B] total ≤ [A] total .
Como se mencionó, esta ecuación se basa en el supuesto de que solo dos estados participan en la fusión: el estado de doble hebra y el estado de bobina aleatoria. Sin embargo, los ácidos nucleicos pueden fundirse a través de varios estados intermedios. Para dar cuenta de un comportamiento tan complicado, se deben utilizar los métodos de la mecánica estadística , que es especialmente relevante para secuencias largas.
El párrafo anterior muestra cómo se relacionan entre sí la temperatura de fusión y los parámetros termodinámicos (Δ G ° o Δ H ° & Δ S °). A partir de la observación de las temperaturas de fusión se pueden determinar experimentalmente los parámetros termodinámicos. Viceversa, y es importante para las aplicaciones, cuando se conocen los parámetros termodinámicos de una secuencia de ácido nucleico determinada, se puede predecir la temperatura de fusión. Resulta que para los oligonucleótidos, estos parámetros pueden aproximarse bien mediante el modelo del vecino más cercano.
La interacción entre bases de diferentes hebras depende en cierta medida de las bases vecinas. En lugar de tratar una hélice de ADN como una cadena de interacciones entre pares de bases , el modelo del vecino más cercano trata una hélice de ADN como una cadena de interacciones entre pares de bases "vecinos". [13] Entonces, por ejemplo, el ADN que se muestra a continuación tiene interacciones con el vecino más cercano indicadas por las flechas.
![{\displaystyle K={\frac {[A][B]}{[AB]}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/25ad2e8e20b03f9c7f894f16b221d1b3a14318a7)
![{\displaystyle \Delta G^{\circ }=-RT\ln {\frac {[A][B]}{[AB]}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/da81847c399c4a9655e6fa28588e55e33b0d8267)
![{\displaystyle T_{m}=-{\frac {\Delta G^{\circ }}{R\ln {\frac {[AB]_{inicial}}{2}}}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/de3cbd630bf8e7823ffe433ae15e5a00572eafaa)
![{\displaystyle T_{m}={\frac {\Delta H^{\circ }}{\Delta S^{\circ }-R\ln {\frac {[AB]_{inicial}}{2}} }}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/bb394a9f8745cc9251cea322cee7cf1426c8257a)
![{\displaystyle T_{m}={\frac {\Delta H^{\circ }}{\Delta S^{\circ }+R\ln([A]_{total}-[B]_{total} /2)}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/3022bc9d919a25a7c2d3018bbca5890f1348f321)
↓ ↓ ↓ ↓ ↓5' C-G-T-T-G-A 3'3' G-C-A-A-C-T 5'La energía libre para formar este ADN a partir de las hebras individuales, Δ G °, se representa (a 37 °C) como
Δ G ° 37 (previsto) = Δ G ° 37 (iniciación C/G) + Δ G ° 37 (CG/GC) + Δ G ° 37 (GT/CA) + Δ G ° 37 (TT/AA) + Δ G ° 37 (TG/AC) + Δ G ° 37 (GA/CT) + Δ G ° 37 (Iniciación A/T)
Excepto por el término de iniciación C/G, el primer término representa la energía libre del primer par de bases, CG, en ausencia de un vecino más cercano. El segundo término incluye tanto la energía libre de formación del segundo par de bases, GC, como la interacción de apilamiento entre este par de bases y el par de bases anterior. Los términos restantes se definen de manera similar. En general, la energía libre para formar un dúplex de ácido nucleico es
,
donde representa la energía libre asociada con uno de los diez posibles pares de nucleótidos vecinos más cercanos y representa su recuento en la secuencia.
Cada término Δ G ° tiene parámetros entálpicos, Δ H °, y entrópicos, Δ S °, por lo que el cambio en energía libre también viene dado por
.
Se han determinado valores de Δ H ° y Δ S ° para los diez posibles pares de interacciones. Estos se dan en la Tabla 1, junto con el valor de Δ G ° calculado a 37 °C. Utilizando estos valores, se calcula que el valor de Δ G 37 ° para el dúplex de ADN que se muestra arriba es −22,4 kJ/mol. El valor experimental es −21,8 kJ/mol.
Los parámetros asociados con los diez grupos de vecinos mostrados en la tabla 1 se determinan a partir de puntos de fusión de dúplex de oligonucleótidos cortos. Resulta que sólo ocho de los diez grupos son independientes.
El modelo del vecino más cercano se puede extender más allá de los pares Watson-Crick para incluir parámetros para las interacciones entre los desajustes y los pares de bases vecinos. [14] Esto permite la estimación de los parámetros termodinámicos de secuencias que contienen desajustes aislados, como por ejemplo (flechas que indican desajustes)
↓↓↓5' G-G-A-C-T-G-A-C-G 3'3' C-C-T-G-G-C-T-G-C 5'Estos parámetros se han ajustado a partir de experimentos de fusión y en la literatura se puede encontrar una extensión de la Tabla 1 que incluye discrepancias.
Una forma más realista de modelar el comportamiento de los ácidos nucleicos parecería ser tener parámetros que dependan de los grupos vecinos a ambos lados de un nucleótido, dando una tabla con entradas como "TCG/AGC". Sin embargo, esto implicaría alrededor de 32 grupos para el emparejamiento Watson-Crick e incluso más para secuencias que contienen discrepancias; el número de experimentos de fusión de ADN necesarios para obtener datos fiables para tantos grupos sería inconvenientemente alto. Sin embargo, existen otros medios para acceder a los parámetros termodinámicos de los ácidos nucleicos: la tecnología de microarrays permite el seguimiento de la hibridación de decenas de miles de secuencias en paralelo. Estos datos, en combinación con la teoría de la adsorción molecular, permiten la determinación de muchos parámetros termodinámicos en un solo experimento [15] e ir más allá del modelo vecino más cercano. [16] En general, las predicciones del método del vecino más cercano concuerdan razonablemente bien con los resultados experimentales, pero existen algunas secuencias atípicas inesperadas que requieren más conocimientos. [16] Finalmente, también debemos mencionar la mayor precisión proporcionada por los ensayos de descompresión de una sola molécula que brindan una gran cantidad de nuevos conocimientos sobre la termodinámica de la hibridación del ADN y también la validez del modelo del vecino más cercano. [17]
