Una mella es una discontinuidad en una molécula de ADN de doble hebra donde no existe un enlace fosfodiéster entre nucleótidos adyacentes de una hebra , normalmente debido a daño o acción enzimática . Las mellas permiten que las hebras de ADN se desenrosquen durante la replicación y también se cree que desempeñan un papel en los mecanismos de reparación de desajustes del ADN que corrigen errores tanto en las hebras hijas principales como en las rezagadas. [1]
El diagrama muestra los efectos de las mellas en el ADN que se cruza en un plásmido retorcido . El mellado se puede utilizar para disipar la energía retenida por los estados que se cruzan. Las muescas permiten que el ADN adopte una forma circular. [2]
El ADN mellado puede ser el resultado de daños en el ADN o de reacciones biomoleculares reguladas y deliberadas que se llevan a cabo en la célula. Durante el procesamiento, el ADN puede sufrir cortes físicos, secado excesivo o enzimas. Un manejo excesivo y brusco al pipetear o agitar en vórtex crea estrés físico que puede provocar roturas y mellas en el ADN. El secado excesivo del ADN también puede romper el enlace fosfodiéster del ADN y provocar mellas. Las enzimas endonucleasas melladas pueden ayudar en este proceso. Se puede formar una rotura monocatenaria (mella) en el ADN mediante la hidrólisis y la posterior eliminación de un grupo fosfato dentro de la estructura helicoidal. Esto conduce a una conformación diferente del ADN, donde se forma un enlace de hidrógeno en lugar de la pieza faltante de la columna vertebral del ADN para preservar la estructura. [3]
Las ligasas son enzimas versátiles y ubicuas que unen los extremos 3' hidroxilo y 5' fosfato para formar un enlace fosfodiéster, lo que las hace esenciales en la reparación del ADN mellado y, en última instancia, en la fidelidad del genoma. Esta función biológica también ha sido extremadamente valiosa para sellar los extremos pegajosos de los plásmidos en la clonación molecular. Su importancia queda atestiguada por el hecho de que la mayoría de los organismos tienen múltiples ligasas dedicadas a vías específicas de reparación del ADN. En las eubacterias, estas ligasas funcionan con NAD+ en lugar de ATP. [4] Cada sitio de mella requiere 1 ATP o 1 NAD+ para impulsar la reparación de la ligasa. [4]
Para unir estos fragmentos, la ligasa avanza a través de tres pasos:
Un ejemplo particular de una ligasa que cataliza el cierre de mella es la ADN ligasa dependiente de NAD+ de E. coli , LigA. La LigA es un ejemplo relevante ya que es estructuralmente similar a un clado de enzimas que se encuentran en todo tipo de bacterias. [7]
Las ligasas tienen un sitio de unión a metales que es capaz de reconocer mellas en el ADN. La ligasa forma un complejo ADN-adenilato, lo que ayuda al reconocimiento. [8] Con la ADN ligasa humana, esto forma un complejo cristalizado. El complejo, que tiene un intermediario ADN-adenilato, permite que la ADN ligasa I instituya un cambio conformacional en el ADN para el aislamiento y posterior reparación de la mella del ADN. [9]
Las mellas monocatenarias actúan como marcadores reconocibles para ayudar a la maquinaria de reparación a distinguir la hebra recién sintetizada (hebra hija) de la hebra modelo (hebra parental). [1] La reparación de errores de coincidencia del ADN (MMR) es un importante sistema de reparación del ADN que ayuda a mantener la plasticidad del genoma corrigiendo los errores de coincidencia o pares de bases que no son de Watson-Crick en un dúplex de ADN. [10] Algunas fuentes de pares de bases no coincidentes incluyen errores de replicación y desaminación del ADN de 5-metilcitosina para formar timina. En la mayoría de las bacterias y eucariotas , la MMR se dirige a la cadena errónea del dúplex no coincidente mediante el reconocimiento de discontinuidades de la cadena, mientras que la MMR en E. coli y bacterias estrechamente relacionadas se dirige a la cadena sobre la base de la ausencia de metilación . Las endonucleasas de mella introducen discontinuidades en las cadenas, o mellas en el ADN, para ambos sistemas respectivos. Los homólogos de Mut L de eucariotas y la mayoría de las bacterias cortan la hebra discontinua para introducir el punto de entrada o terminación de la reacción de escisión. De manera similar, en E. coli, Mut H corta la hebra no metilada del dúplex para introducir el punto de entrada de escisión. [11] Específicamente para los eucariotas, el mecanismo de elongación de la replicación del ADN entre la cadena principal y la rezagada difiere. En la cadena rezagada, existen mellas entre los fragmentos de Okazaki y son fácilmente reconocibles por la maquinaria de reparación de errores de coincidencia del ADN antes de la ligación . Debido a la replicación continua que se produce en la cadena principal, el mecanismo allí es un poco más complejo. Durante la replicación, las enzimas de replicación agregan ribonucleótidos y estos ribonucleótidos son cortados por una enzima llamada RNasa H2 . [1] Juntos, la presencia de una mella y un ribonucleótido hacen que la cadena principal sea fácilmente reconocible para la maquinaria de reparación de errores de coincidencia del ADN.
La traducción de Nick es un proceso biológico en el que una mella de ADN monocatenario sirve como marcador para que la ADN polimerasa escinda y reemplace los nucleótidos posiblemente dañados. [3] Al final del segmento sobre el que actúa la ADN polimerasa, la ADN ligasa debe reparar el segmento final de la columna vertebral del ADN para completar el proceso de reparación. [4] En un entorno de laboratorio, esto se puede utilizar para introducir nucleótidos fluorescentes u otros nucleótidos marcados induciendo intencionadamente mellas monocatenarias específicas del sitio en el ADN in vitro y luego agregando el ADN mellado a un entorno rico en ADN polimerasa y nucleótidos marcados. . Luego, la ADN polimerasa reemplaza los nucleótidos de ADN con los marcados, comenzando en el sitio de la mella monocatenaria.
El ADN mellado juega un papel importante en muchas funciones biológicas. Por ejemplo, las mellas monocatenarias en el ADN pueden servir como marcadores biológicos útiles para la enzima topoisomerasa que desenrolla el ADN empaquetado y es fundamental para la replicación y transcripción del ADN . En estos casos, el ADN mellado no es el resultado de un daño celular no deseado. [2]
La topoisomerasa-1 actúa preferentemente en las mellas del ADN para escindir las zonas adyacentes a la mella y luego enrolla o desenrolla las topologías complejas asociadas con el ADN empaquetado. En este caso, la mella en el ADN sirve como marcador de la rotura de una sola hebra y su posterior desenrollado. [12] Es posible que este no sea un proceso altamente conservado. La topoisomerasa puede causar deleciones cortas cuando escinde enlaces, porque tanto los productos de ADN de longitud completa como las hebras de deleción cortas se consideran productos de la escisión de la topoisomerasa, mientras que los mutantes inactivos solo produjeron hebras de ADN de longitud completa. [13]
Las mellas en el ADN también dan lugar a diferentes propiedades estructurales, pueden participar en la reparación de daños causados por la radiación ultravioleta y se utilizan en los pasos primarios que permiten la recombinación genética . [14]
La inactividad de la mella es un proceso biológico en el que la ADN polimerasa puede ralentizar o detener su actividad de agregar bases a una nueva cadena hija durante la replicación del ADN en un sitio de mella. [4] Esto es particularmente relevante para los fragmentos de Okazaki en la cadena retrasada en la replicación del ADN de doble cadena porque la dirección de replicación es opuesta a la dirección de la ADN polimerasa , por lo tanto, el ralentí de la mella juega un papel en detener el complejo mientras se replica en la dirección inversa en pequeños fragmentos (fragmentos de Okazaki) y tiene que detenerse y reposicionarse entre todos y cada uno de los fragmentos de ADN.
La estructura del ADN cambia cuando se introduce una mella monocatenaria. [14] La estabilidad disminuye a medida que una rotura en la columna vertebral de fosfodiéster permite que el ADN se desenrolle , ya que la tensión acumulada por la torsión y el empaquetamiento ya no se resiste con tanta fuerza. [12] El ADN mellado es más susceptible a la degradación debido a esta estabilidad reducida.
El sitio nic o región de mella se encuentra dentro del sitio de origen de transferencia ( oriT ) y es clave para iniciar la conjugación bacteriana . Una sola hebra de ADN, llamada hebra T , es cortada por una enzima llamada relaxasa . [15] Esta cadena única finalmente se transfiere a la célula receptora durante el proceso de conjugación bacteriana . Sin embargo, antes de que pueda ocurrir esta escisión, es necesario que un grupo de proteínas se una al sitio oriT . Este grupo de proteínas se llama relaxosoma. [15] Se cree que partes del sitio oriT están dobladas de una manera que crea una interacción entre las proteínas del relaxosoma y el sitio nic . [15]
La escisión de la cadena T implica que la relaxasa corte un enlace fosfodiéster en el sitio nic. [15] La hebra escindida queda con un grupo hidroxilo en el extremo 3', lo que puede permitir que la hebra forme un plásmido circular después de moverse hacia la célula receptora. [16] [17]
Las mellas de ADN promueven la formación de cruces durante la meiosis y dichas mellas están protegidas de la ligadura por la exonucleasa 1 (Exo1). [18]