Un fluoróforo (o fluorocromo , de manera similar a un cromóforo ) es un compuesto químico fluorescente que puede reemitir luz tras la excitación de la luz. Los fluoróforos suelen contener varios grupos aromáticos combinados , o moléculas planas o cíclicas con varios enlaces π . [1]
Los fluoróforos se utilizan en ocasiones solos, como trazador en fluidos, como tinte para teñir determinadas estructuras, como sustrato de enzimas , o como sonda o indicador (cuando su fluorescencia se ve afectada por aspectos ambientales como la polaridad o los iones). De manera más general, están unidos covalentemente a una macromolécula y sirven como marcador (o colorante, etiqueta o indicador) para reactivos afines o bioactivos ( anticuerpos , péptidos, ácidos nucleicos). Los fluoróforos se utilizan especialmente para teñir tejidos, células o materiales en una variedad de métodos analíticos, es decir, imágenes fluorescentes y espectroscopia .
La fluoresceína , a través de su isotiocianato de fluoresceína derivado isotiocianato reactivo con aminas (FITC), ha sido uno de los fluoróforos más populares. Del marcaje de anticuerpos, las aplicaciones se han extendido a los ácidos nucleicos gracias a la carboxifluoresceína (FAM), TET,...). Otros fluoróforos históricamente comunes son los derivados de rodamina (TRITC), cumarina y cianina . [2] Las nuevas generaciones de fluoróforos, muchos de los cuales son patentados, a menudo funcionan mejor, siendo más fotoestables, más brillantes y/o menos sensibles al pH que los tintes tradicionales con excitación y emisión comparables. [3] [4]
Fluorescencia
El fluoróforo absorbe energía luminosa de una longitud de onda específica y reemite luz en una longitud de onda más larga. Las longitudes de onda absorbidas , la eficiencia de transferencia de energía y el tiempo antes de la emisión dependen tanto de la estructura del fluoróforo como de su entorno químico, ya que la molécula en su estado excitado interactúa con las moléculas circundantes. Las longitudes de onda de máxima absorción (≈ excitación) y emisión (por ejemplo, Absorción/Emisión = 485 nm/517 nm) son los términos típicos utilizados para referirse a un fluoróforo determinado, pero puede ser importante considerar todo el espectro. El espectro de longitudes de onda de excitación puede ser una banda muy estrecha o más amplia, o puede estar por encima de un nivel de corte. El espectro de emisión suele ser más nítido que el espectro de excitación, tiene una longitud de onda más larga y, en consecuencia, una energía más baja. Las energías de excitación varían desde el ultravioleta hasta el espectro visible , y las energías de emisión pueden continuar desde la luz visible hasta la región del infrarrojo cercano .
Las principales características de los fluoróforos son:
Longitud de onda máxima de excitación y emisión (expresada en nanómetros (nm)): corresponde al pico en los espectros de excitación y emisión (normalmente un pico cada uno).
Coeficiente de absorción molar (en mol −1 cm −1 ): vincula la cantidad de luz absorbida, a una longitud de onda determinada, con la concentración de fluoróforo en solución.
Rendimiento cuántico : eficiencia de la energía transferida de la luz incidente a la fluorescencia emitida (= número de fotones emitidos por fotones absorbidos).
Vida útil (en picosegundos): duración del estado excitado de un fluoróforo antes de volver a su estado fundamental. Se refiere al tiempo que tarda una población de fluoróforos excitados en desintegrarse a 1/e (≈0,368) de la cantidad original.
Desplazamiento de Stokes : diferencia entre las longitudes de onda de máxima excitación y máxima de emisión.
Fracción oscura : proporción de las moléculas activas en la emisión de fluorescencia. Para los puntos cuánticos , la microscopía prolongada de una sola molécula mostró que entre el 20 y el 90% de todas las partículas nunca emiten fluorescencia. [5] Por otro lado, las nanopartículas de polímeros conjugados (Pdots) casi no muestran fracción oscura en su fluorescencia. [6] Las proteínas fluorescentes pueden tener una fracción oscura debido al mal plegamiento de las proteínas o a la formación defectuosa de cromóforos. [7]
Estas características impulsan otras propiedades, incluido el fotoblanqueo o la fotorresistencia (pérdida de fluorescencia tras la excitación de luz continua). Se deben considerar otros parámetros, ya que la polaridad de la molécula del fluoróforo, el tamaño y la forma del fluoróforo (es decir, el patrón de fluorescencia de polarización ) y otros factores pueden cambiar el comportamiento de los fluoróforos.
Las partículas fluorescentes como los puntos cuánticos : de 2 a 10 nm de diámetro, de 100 a 100.000 átomos, también se consideran fluoróforos. [9]
El tamaño del fluoróforo podría obstaculizar estéricamente la molécula marcada y afectar la polaridad de la fluorescencia.
Familias
Fluorescencia de diferentes sustancias bajo luz ultravioleta. El verde es fluoresceína, el rojo es rodamina B, el amarillo es rodamina 6G, el azul es quinina y el morado es una mezcla de quinina y rodamina 6g. Las soluciones tienen una concentración de aproximadamente 0,001% en agua.
Las moléculas de fluoróforo podrían utilizarse solas o servir como motivo fluorescente de un sistema funcional. Según la complejidad molecular y los métodos sintéticos, las moléculas de fluoróforo podrían clasificarse generalmente en cuatro categorías: proteínas y péptidos, pequeños compuestos orgánicos, oligómeros y polímeros sintéticos y sistemas de múltiples componentes. [10] [11]
Las proteínas fluorescentes GFP (verde), YFP (amarilla) y RFP (roja) se pueden unir a otras proteínas específicas para formar una proteína de fusión , sintetizada en células después de la transfección de un portador de plásmido adecuado .
Los fluoróforos orgánicos no proteicos pertenecen a las siguientes familias químicas principales:
Estos fluoróforos emiten fluorescencia debido a electrones deslocalizados que pueden saltar una banda y estabilizar la energía absorbida. El benceno , uno de los hidrocarburos aromáticos más simples, por ejemplo, se excita a 254 nm y emite a 300 nm. [12] Esto discrimina los fluoróforos de los puntos cuánticos, que son nanopartículas semiconductoras fluorescentes .
Además, pueden estar presentes varios grupos funcionales para alterar sus propiedades, como la solubilidad, o conferir propiedades especiales, como el ácido borónico que se une a azúcares o múltiples grupos carboxilo para unirse a ciertos cationes. Cuando el tinte contiene un grupo donador de electrones y un grupo aceptor de electrones en extremos opuestos del sistema aromático, este tinte probablemente será sensible a la polaridad del medio ambiente ( solvatocrómico ), por lo que se denomina sensible al medio ambiente. A menudo se utilizan colorantes en el interior de las células, que son impermeables a las moléculas cargadas, como resultado de esto los grupos carboxilo se convierten en un éster, que se elimina mediante esterasas dentro de las células, por ejemplo, fura-2AM y diacetato de fluoresceína.
Las siguientes familias de tintes son grupos de marcas registradas y no necesariamente comparten similitudes estructurales.
Núcleos de células endoteliales de la arteria pulmonar bovina teñidos de azul con DAPI , mitocondrias teñidas de rojo con MitoTracker Red CMXRos y actina F teñidas de verde con faloidina Alexa Fluor 488 y fotografiadas en un microscopio fluorescente.
Ejemplos de fluoróforos que se encuentran con frecuencia
Colorantes reactivos y conjugados.
Abreviaturas:
Ex (nm): longitud de onda de excitación en nanómetros
Em (nm): longitud de onda de emisión en nanómetros
^ Juan Carlos Stockert, Alfonso Blázquez-Castro (2017). "Capítulo 3 Tintes y Fluorocromos". Microscopía de fluorescencia en ciencias biológicas . Editores científicos de Bentham. págs. 61–95. ISBN 978-1-68108-519-7. Consultado el 24 de diciembre de 2017 .
^ Rietdorf J (2005). Técnicas microscópicas. Avances en Ingeniería Bioquímica/Biotecnología. Berlín: Springer. págs. 246–9. ISBN3-540-23698-8. Consultado el 13 de diciembre de 2008 .
^ ab Tsien RY; Carroñero A (1995). "Fluoróforos para microscopía confocal". En Pawley JB (ed.). Manual de microscopía confocal biológica . Nueva York: Plenum Press. págs. 267–74. ISBN0-306-44826-2. Consultado el 13 de diciembre de 2008 .
^ Lakowicz, JR (2006). Principios de espectroscopia de fluorescencia (3ª ed.). Saltador. pag. 954.ISBN978-0-387-31278-1.
^ Pons T, Medintz IL, Farrell D, Wang X, Grimes AF, English DS, Berti L, Mattoussi H (2011). "Los estudios de colocalización de una sola molécula arrojan luz sobre la idea de emitir completamente versus puntos cuánticos únicos oscuros". Pequeño . 7 (14): 2101–2108. doi :10.1002/smll.201100802. PMID 21710484.
^ Koner AL, Krndija D, Hou Q, Sherratt DJ, Howarth M (2013). "Las nanopartículas de polímero conjugado terminadas en hidroxi tienen una fracción brillante cercana a la unidad y revelan la dependencia del colesterol de los nanodominios IGF1R". ACS Nano . 7 (2): 1137-1144. doi : 10.1021/nn3042122 . PMC 3584654 . PMID 23330847.
^ García-Parajo MF, Segers-Nolten GM, Veerman JA, Greve J, van Hulst NF (2000). "Dinámica impulsada por la luz en tiempo real de la emisión de fluorescencia en moléculas individuales de proteína fluorescente verde". PNAS . 97 (13): 7237–7242. Código bibliográfico : 2000PNAS...97.7237G. doi : 10.1073/pnas.97.13.7237 . PMC 16529 . PMID 10860989.
^ Cozens, Tom (16 de diciembre de 2020). "La molécula fluorescente bate el récord de tamaño de los tintes emisores de verde". chemistryworld.com . Consultado el 3 de diciembre de 2021 .
^ Li Z, Zhao X, Huang C, Gong X (2019). "Avances recientes en la fabricación ecológica de concentradores solares luminiscentes utilizando puntos cuánticos no tóxicos como fluoróforos". J. Mater. Química. C . 7 (40): 12373–12387. doi :10.1039/C9TC03520F. S2CID 203003761.
^ Liu, J.; Liu, C.; He, W. (2013), "Fluoróforos y sus aplicaciones como sondas moleculares en células vivas", Curr. Org. Química. , 17 (6): 564–579, doi :10.2174/1385272811317060003
^ Juan Carlos Stockert, Alfonso Blázquez-Castro (2017). "Capítulo 4 Etiquetas fluorescentes". Microscopía de fluorescencia en ciencias biológicas . Editores científicos de Bentham. págs. 96-134. ISBN978-1-68108-519-7. Consultado el 24 de diciembre de 2017 .
^ Omlc.ogi.edu
^ abcde Columbia Biociencias
^ Bindels, Daphne S.; Haarbosch, Lindsay; van Weeren, Laura; Postma, Marten; Wiese, Katrin E.; Mastop, Marieke; Aumonier, Sylvain; San Gotardo, Guillaume; Royant, Antoine; Hink, Mark A.; Gadella, Theodorus WJ (enero de 2017). "mScarlet: una proteína fluorescente roja monomérica brillante para imágenes celulares". Métodos de la naturaleza . 14 (1): 53–56. doi :10.1038/nmeth.4074. ISSN 1548-7105. PMID 27869816. S2CID 3539874.
^ Sirbu, Dumitru; Luli, Saimir; Leslie, Jack; Oakley, Fiona; Benniston, Andrew C. (2019). "Imágenes ópticas in vivo mejoradas de la respuesta inflamatoria a la lesión hepática aguda en ratones C57BL / 6 utilizando un tinte BODIPY de infrarrojo cercano altamente brillante". ChemMedChem . 14 (10): 995–999. doi : 10.1002/cmdc.201900181. ISSN 1860-7187. PMID 30920173. S2CID 85544665.
^ Taki, Masayasu (2013). "Capítulo 5. Imágenes y detección de cadmio en las células". En Astrid Sigel; Helmut Sigel; Roland KO Sigel (eds.). Cadmio: de la toxicología a la esencialidad . Iones metálicos en ciencias biológicas. vol. 11. Saltador. págs. 99-115. doi :10.1007/978-94-007-5179-8_5. PMID 23430772.
^ Sirbu, Dumitru; Carnicero, John B.; Waddell, Paul G.; András, Peter; Benniston, Andrew C. (18 de septiembre de 2017). "Tintes acoplados al estado de transferencia de carga y estado excitado localmente como sondas de activación de neuronas ópticamente sensibles" (PDF) . Química: una revista europea . 23 (58): 14639–14649. doi :10.1002/chem.201703366. ISSN 0947-6539. PMID 28833695.
^ Jiang, Xiqian; Wang, Lingfei; Carroll, Shaina L.; Chen, Jianwei; Wang, Meng C.; Wang, Jin (20 de agosto de 2018). "Desafíos y oportunidades para sondas fluorescentes de moléculas pequeñas en aplicaciones de biología redox". Antioxidantes y señalización redox . 29 (6): 518–540. doi :10.1089/ars.2017.7491. ISSN 1523-0864. PMC 6056262 . PMID 29320869.
enlaces externos
La base de datos de tintes fluorescentes.
Tabla de fluorocromos
El manual de sondas moleculares: un recurso integral para la tecnología de fluorescencia y sus aplicaciones.
