Rodamina , una molécula fluorescente que se utiliza a menudo en sensores de moléculas pequeñas.
Los sensores de moléculas pequeñas son una forma eficaz de detectar la presencia de iones metálicos en solución. [1] Aunque existen muchos tipos, la mayoría de los sensores de moléculas pequeñas comprenden una subunidad que se une selectivamente a un metal que a su vez induce un cambio en una subunidad fluorescente . Este cambio se puede observar en el espectro del sensor de moléculas pequeñas , que se puede monitorear mediante un sistema de detección como un microscopio o un fotodiodo . [2] Existen diferentes sondas para una variedad de aplicaciones, cada una con diferentes constantes de disociación con respecto a un metal en particular, diferentes propiedades fluorescentes y sensibilidades. Son muy prometedores como forma de investigar procesos biológicos mediante el seguimiento de iones metálicos en bajas concentraciones en sistemas biológicos. Dado que son, por definición, pequeños y a menudo capaces de entrar en sistemas biológicos, son propicios para muchas aplicaciones para las que otros biodetectores más tradicionales son menos eficaces o no son adecuados. [3]
Usos
Una bomba de sodio-potasio que provoca cambios en las concentraciones de iones metálicos en un sistema biológico.
Los iones metálicos son esenciales para prácticamente todos los sistemas biológicos y, por lo tanto, estudiar sus concentraciones con sondas eficaces es muy ventajoso. Dado que los iones metálicos son clave para las causas del cáncer , la diabetes y otras enfermedades, monitorearlos con sondas que pueden proporcionar información sobre sus concentraciones con resolución espacial y temporal es de gran interés para la comunidad científica. [3] Hay muchas aplicaciones que uno puede imaginar para sensores de moléculas pequeñas. Se ha demostrado que se pueden utilizar para diferenciar eficazmente entre concentraciones aceptables y nocivas de mercurio en el pescado . [4] Además, dado que algunos tipos de neuronas absorben zinc durante su funcionamiento, estas sondas se pueden utilizar como una forma de rastrear la actividad en el cerebro y podrían servir como una alternativa eficaz a la resonancia magnética funcional . [5] También se puede rastrear y cuantificar el crecimiento de una célula , como un fibroblasto , que absorbe iones metálicos a medida que se construye. [3] Se pueden rastrear muchos otros procesos biológicos utilizando sensores de moléculas pequeñas, ya que cambian las concentraciones de metales a medida que ocurren, que luego se pueden monitorear. Aún así, el sensor debe adaptarse a su entorno específico y a sus requisitos de detección. Dependiendo de la aplicación, el sensor de metales debe ser selectivo para un determinado tipo de metal y, especialmente, debe poder unirse a su metal objetivo con mayor afinidad que los metales que existen naturalmente en altas concentraciones dentro de la célula. Además, deberían proporcionar una respuesta con una fuerte modulación en el espectro fluorescente y, por tanto, proporcionar una alta relación señal-ruido . Por último, es fundamental que un sensor no sea tóxico para el sistema biológico en el que se utiliza. [3]
Mecanismos de detección
Caricatura que muestra un cambio en el espectro de un sensor de molécula pequeña tras la unión de un metal
La mayoría de los mecanismos de detección implicados en sensores de moléculas pequeñas comprenden cierta modulación en el comportamiento fluorescente de la molécula sensora al unirse al metal objetivo. Cuando un metal se coordina con dicho sensor, puede mejorar o reducir la emisión fluorescente original. El primero se conoce como efecto de fluorescencia de mejora de la quelación (CHEF), mientras que el segundo se llama efecto de extinción de mejora de la quelación (CHEQ). Al cambiar la intensidad de la emisión en diferentes longitudes de onda, el espectro fluorescente resultante puede atenuarse, amplificarse o desplazarse tras la unión y disociación de un metal. Este cambio en los espectros se puede monitorear usando un detector como un microscopio o un fotodiodo. [2] [6]
A continuación se enumeran algunos ejemplos de mecanismos mediante los cuales se modula la emisión. Su participación en CHEQ o CHEF depende del metal y del sensor de molécula pequeña en cuestión.
Mecanismos primarios de detección
Extinción de fluorescencia paramagnética, la concesión de nuevos estados electrónicos al unirse a un átomo de metal paramagnético [2]
Transferencia de carga fotoinducida (PCT), la modulación de niveles de energía en un complejo mediante transferencia de carga dentro de un sistema pi conjugado . [2]
Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), [2] la transferencia de un excitón de un donante a un aceptor, modulando el espectro de emisión. [2] [7]
Formación de excímero/exciplex , la formación de un estado que es un híbrido de los estados fundamental y excitado. Esto tiene nuevas propiedades fluorescentes. [2]
Quimiodosímetros, complejos que sufren reacciones irreversibles con otras especies al unirse a un metal para formar nuevos compuestos con nuevos espectros fluorescentes. [2]
fluoróforos
Estructura de la quinolinaun ejemplo de un compuesto del grupo Dansyl, cloruro de Dansyl
Los fluoróforos son esenciales para nuestra medición del evento de unión del metal e, indirectamente, de la concentración del metal. Hay muchos tipos, todos con diferentes propiedades que los hacen ventajosos para diferentes aplicaciones. Algunos funcionan como pequeños sensores metálicos completamente por sí solos, mientras que otros deben formar complejos con una subunidad que pueda quelar o unir un ion metálico. La rodamina, por ejemplo, sufre un cambio de conformación al unirse a un ion metálico. Al hacerlo, cambia entre una forma espirocíclica incolora y no fluorescente a una forma cíclica abierta, fluorescente y rosa. [2] [8] Se han desarrollado sensores basados en quinolina que forman complejos luminiscentes con Cd(II) y fluorescentes con Zn(II). Se supone que funciona cambiando su estado luminiscente más bajo de n– π * a π – π * cuando se coordina con un metal. [2] [9] [10]
Cuando el grupo Dansyl DNS se une a un metal, pierde hidrógeno de sulfonamida , lo que provoca la extinción de la fluorescencia a través de un mecanismo de PET o PET inverso en el que se transfiere un electrón hacia o desde el metal que está unido. . [11]
Ejemplos
Zinc
El zinc es uno de los iones metálicos más comunes en los sistemas biológicos. [6] Los sensores de moléculas pequeñas incluyen:
ZX1, un compuesto que comprende una subunidad de unión al zinc dipicolilamina (DPA) que tiene mayor afinidad por el zinc que otras especies que se encuentran en solución, como Ca y Mg. [12]
Zinpyr-1 (ZP1), un compuesto que contiene un compuesto fluorescente de diclorofluoresceína unido a dos especies de 2-picolamina (DPA) que se unen a Zn (II). ZP1 es parte de una familia de sensores de zinc conocida como serie Zinpyr, cuyos miembros son variantes de ZP1 para permitir afinidades y perfiles de fluorescencia específicos. [3]
Sensores ZnAF-1 que comprenden un donante de arilo y un aceptor de xantenona y tienen un gran cambio en la fluorescencia al unirse al Zn (II). Se han utilizado para estudiar la captación de Zn(II) en las neuronas piramidales CA3. [3] [5]
GFZnP: se preparó una nueva familia de 12 miembros de quimiosensores GFP fluorescentes para la detección de Zn2+ en muestras biológicas con microscopía de dos fotones. Éstas son la combinación del motivo 8-aminoquinolina y la unidad cromófora GFP, lo que da como resultado una respuesta fluorescente mejorada al Zn2+. Los miembros más eficaces son GFZnP ED, GFZnP Pic y GFZnP dipic. Los GFZnP tienen una síntesis simple y están disponibles comercialmente, lo que los convierte en uno de los sensores Zn2+ de dos fotones más accesibles. La caracterización espectroscópica de la familia de sondas resalta su brillante emisión fluorescente (ε x Φ > 200) a λem = 520 nm tras la excitación con luz λex = 450 nm. La sección transversal de acción 2P de las sondas alcanza δ´Φcomp > 5 GM en λex, 2P=900 nm, con un aumento de hasta 200 veces, lo que las convierte en una de las mejores sondas de dos fotones para Zn2+. Los miembros de la familia de sensores, especialmente GFZnP ED, GFZnP Pic y GFZnP dipic, exhiben una alta selectividad por Zn2+ con una afinidad en el rango nanomolar (nM), excelente solubilidad en agua y usabilidad en un amplio rango de pH (pH > 6). . La aplicabilidad de las sondas seleccionadas se demostró mediante microscopía epifluorescente y 2P en células cultivadas y cortes de cerebro. Este trabajo amplía la caja de herramientas de sensores de zinc de dos fotones eficientes con una nueva y valiosa familia. [13]
GFZnP OMe: Se publica un sensor Zn2+ fluorescente alternativo basado en GFP para microscopía de dos fotones y aplicaciones biológicas y microscópicas relacionadas. Se compone de un andamio de 8-metoxiquinolina. Tiene excelentes características fotofísicas, incluida una mejora de la fluorescencia de 37 veces con l(ex) = 440 nm y l(em) = 505 nm. La sección transversal de dos fotones alcanza los 73 GM a 880 nm. [14]
GFZnP BIPY: quimiosensor fluorescente selectivo de Zn2+ con una fracción quelante de 2,2'-bipiridina. Fue eficaz en un rango de pH fisiológicamente relevante y se informan excelentes características fotofísicas, incluida una mejora de la fluorescencia de 53 veces con máximos de excitación y emisión a 422 nm y 492 nm, respectivamente. Se informa una alta sección transversal de dos fotones de 3,0 GM a 840 nm, así como una excelente selectividad de iones metálicos. Se llevaron a cabo experimentos in vitro en cultivos celulares HEK 293 utilizando microscopía de dos fotones, lo que demuestra su aplicabilidad. [15]
Cobre
El cobre es un metal biológicamente importante de detectar. Tiene muchos sensores desarrollados para ello, incluidos:
CTAP-1, un sensor que muestra una respuesta en la región UV cuando Cu(I) se une a un motivo de corona de azatetratia que a su vez excita un tinte a base de pirazolina que está adherido. Para utilizar la sonda, se excita a 365 nm. Si está unido a Cu, aumentará su intensidad de fluorescencia. CTAP-1 es eficaz ya que tiene una gran modulación en su espectro al unirse a Cu y es selectivo para la unión de Cu sobre otros metales. [3] [6]
Coppersensor-1 (CS1) que comprende un motivo rico en tioéter que se une al Cu(I) provocando la excitación de un colorante de boro-dipirrometeno ( BODIPY ) en la región visible. La sonda tiene buena selectividad para Cu(I) sobre metales alcalinotérreos , Cu(II) y metales del bloque D. [3] [6]
Hierro
El hierro se utiliza mucho en los sistemas biológicos, hecho bien conocido por su papel en la hemoglobina . Para ello, existen muchos sensores de moléculas pequeñas que incluyen:
Pryrene-TEMPO, en el que la unión del hierro a TEMPO apaga la fluorescencia del pireno cuando no hay Fe (II) unido. Sin embargo, al unirse, el TEMPO se reduce y el pireno recupera la fluorescencia. Esta sonda está limitada porque los radicales libres no deseados pueden generar una respuesta análoga y solo puede usarse en una solución ácida. [6] [16]
DansSQ, en el que la unión de Fe (II) aumenta la fluorescencia a 460 nm. Consiste en un grupo Dansyl unido a estirilquinolina y opera mediante la interrupción de la transferencia de carga intramolecular tras la unión de Fe (II). Tiene la limitación de que sólo es soluble en acetonitrilo en H2O al 10% . [6]
Cobalto
Se han fabricado sensores de cobalto que aprovechan la rotura de los enlaces de CO por parte del Co (II) en una sonda fluorescente conocida como Cobalt Probe 1 (CP1). [17]
Mercurio
El mercurio es un metal pesado tóxico y, como tal, es importante poder detectarlo en los sistemas biológicos. Los sensores incluyen:
Mercury Sensors (MS), una familia de sensores que comprende complejos de fluoresceína y naftofluoresceína. La sonda MS1 aumenta su emisión al unirse al Hg(II), manteniendo al mismo tiempo una gran afinidad por el mercurio sobre otros iones de metales pesados. [3]
El sensor S3 se basa en un complejo BODIPY que experimenta un aumento significativo de fluorescencia tras la unión de Hg(II). [3] [18]
MF1 utiliza un quelante de tioéter suave para Hg (II) unido a un indicador de xantenona similar a la fluoresceína. Tiene buen contraste al enlazar mercurio y buena selectividad. MF1 es lo suficientemente sensible como para proponer su uso para analizar peces en busca de niveles tóxicos de mercurio. [3] [4]
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