En bioquímica , la desnaturalización es un proceso en el que las proteínas o los ácidos nucleicos pierden la estructura cuaternaria , la estructura terciaria y la estructura secundaria que está presente en su estado nativo , mediante la aplicación de algún estrés externo o compuesto como un ácido o base fuerte , un concentrado. sal inorgánica , un disolvente orgánico (p. ej., alcohol o cloroformo ), agitación y radiación o calor . [1] Si las proteínas en una célula viva se desnaturalizan, esto resulta en una interrupción de la actividad celular y posiblemente en la muerte celular. La desnaturalización de las proteínas también es consecuencia de la muerte celular. [2] [3] Las proteínas desnaturalizadas pueden exhibir una amplia gama de características, desde cambios conformacionales y pérdida de solubilidad hasta agregación debido a la exposición de grupos hidrofóbicos . La pérdida de solubilidad como resultado de la desnaturalización se llama coagulación . [4] Las proteínas desnaturalizadas pierden su estructura tridimensional y, por lo tanto, no pueden funcionar.
El plegamiento de proteínas es clave para determinar si una proteína globular o de membrana puede hacer su trabajo correctamente; debe doblarse en la forma correcta para funcionar. Sin embargo, los enlaces de hidrógeno , que desempeñan un papel importante en el plegamiento, son bastante débiles y, por lo tanto, se ven afectados fácilmente por el calor, la acidez, las concentraciones variables de sal y otros factores estresantes que pueden desnaturalizar la proteína. Ésta es una de las razones por las que la homeostasis es fisiológicamente necesaria en muchas formas de vida .
Este concepto no tiene relación con el alcohol desnaturalizado , que es alcohol que ha sido mezclado con aditivos para hacerlo inadecuado para el consumo humano.
Cuando se cocinan los alimentos, algunas de sus proteínas se desnaturalizan. Por eso los huevos duros se vuelven duros y la carne cocida se vuelve firme.
Un ejemplo clásico de desnaturalización de las proteínas proviene de las claras de huevo, que suelen ser en gran parte albúminas de huevo en agua. Recién salidas de los huevos, las claras son transparentes y líquidas. Cocinar las claras térmicamente inestables las vuelve opacas, formando una masa sólida interconectada. [5] La misma transformación se puede efectuar con un producto químico desnaturalizante. Verter claras de huevo en un vaso de acetona también hará que las claras de huevo se vuelvan translúcidas y sólidas. La piel que se forma en la leche cuajada es otro ejemplo común de proteína desnaturalizada. El aperitivo frío conocido como ceviche se prepara "cocinando" químicamente pescado y mariscos crudos en una marinada ácida de cítricos, sin calor. [6]
Las proteínas desnaturalizadas pueden exhibir una amplia gama de características, desde pérdida de solubilidad hasta agregación de proteínas .
Las proteínas o polipéptidos son polímeros de aminoácidos . Una proteína es creada por ribosomas que "leen" el ARN codificado por codones en el gen y ensamblan la combinación de aminoácidos necesaria a partir de la instrucción genética , en un proceso conocido como traducción . La cadena proteica recién creada sufre una modificación postraduccional , en la que se añaden átomos o moléculas adicionales , por ejemplo cobre , zinc o hierro . Una vez que se ha completado este proceso de modificación postraduccional, la proteína comienza a plegarse (a veces de forma espontánea y a veces con ayuda enzimática ), enrollándose sobre sí misma de modo que los elementos hidrofóbicos de la proteína quedan enterrados profundamente dentro de la estructura y los elementos hidrofílicos terminan en la superficie. afuera. La forma final de una proteína determina cómo interactúa con su entorno.
El plegamiento de proteínas consiste en un equilibrio entre una cantidad sustancial de interacciones intramoleculares débiles dentro de una proteína (interacciones hidrofóbicas, electrostáticas y de Van Der Waals) y las interacciones proteína-solvente. [7] Como resultado, este proceso depende en gran medida del estado ambiental en el que reside la proteína. [7] Estas condiciones ambientales incluyen, entre otras, la temperatura , la salinidad , la presión y los disolventes que intervienen. [7] En consecuencia, cualquier exposición a tensiones extremas (por ejemplo, calor o radiación, altas concentraciones de sales inorgánicas, ácidos y bases fuertes) puede alterar la interacción de una proteína e inevitablemente conducir a la desnaturalización. [8]
Cuando una proteína se desnaturaliza, las estructuras secundaria y terciaria se alteran pero los enlaces peptídicos de la estructura primaria entre los aminoácidos quedan intactos. Dado que todos los niveles estructurales de la proteína determinan su función, la proteína ya no puede realizar su función una vez que ha sido desnaturalizada. Esto contrasta con las proteínas intrínsecamente no estructuradas , que están desplegadas en su estado nativo , pero aún funcionalmente activas y tienden a plegarse al unirse a su objetivo biológico. [9]
La mayoría de los sustratos biológicos pierden su función biológica cuando se desnaturalizan. Por ejemplo, las enzimas pierden su actividad porque los sustratos ya no pueden unirse al sitio activo [11] y porque los residuos de aminoácidos involucrados en la estabilización de los estados de transición de los sustratos ya no están en condiciones de poder hacerlo. El proceso desnaturalizante y la pérdida de actividad asociada se pueden medir utilizando técnicas como la interferometría de doble polarización , CD , QCM-D y MP-SPR .
Se sabe que, al atacar las proteínas, los metales pesados alteran la función y la actividad llevada a cabo por las proteínas. [12] Es importante señalar que los metales pesados se clasifican en categorías que consisten en metales de transición y una cantidad selecta de metaloide. [12] Estos metales, cuando interactúan con proteínas nativas plegadas, tienden a desempeñar un papel en la obstrucción de su actividad biológica. [12] Esta interferencia se puede llevar a cabo de diferentes maneras. Estos metales pesados pueden formar un complejo con los grupos funcionales de la cadena lateral presentes en una proteína o formar enlaces con tioles libres. [12] Los metales pesados también desempeñan un papel en la oxidación de las cadenas laterales de aminoácidos presentes en las proteínas. [12] Además de esto, al interactuar con metaloproteínas, los metales pesados pueden dislocarse y reemplazar iones metálicos clave. [12] Como resultado, los metales pesados pueden interferir con las proteínas plegadas, lo que puede impedir en gran medida la estabilidad y actividad de las proteínas.
En muchos casos, la desnaturalización es reversible (las proteínas pueden recuperar su estado original cuando se elimina la influencia desnaturalizante). Este proceso se puede llamar renaturalización. [13] Esta comprensión ha llevado a la noción de que toda la información necesaria para que las proteínas asuman su estado nativo estaba codificada en la estructura primaria de la proteína y, por lo tanto, en el ADN que codifica la proteína, la llamada " termodinámica de Anfinsen ". hipótesis ". [14]
La desnaturalización también puede ser irreversible. Esta irreversibilidad suele ser cinética, no termodinámica, ya que una proteína plegada generalmente tiene menor energía libre que cuando está desplegada. A través de la irreversibilidad cinética, el hecho de que la proteína esté atrapada en un mínimo local puede impedir que se vuelva a plegar después de haber sido desnaturalizada irreversiblemente. [15]
La desnaturalización también puede ser causada por cambios en el pH que pueden afectar la química de los aminoácidos y sus residuos. Los grupos ionizables de los aminoácidos pueden ionizarse cuando se producen cambios de pH. Un cambio de pH a condiciones más ácidas o más básicas puede inducir el desarrollo. [16] El despliegue inducido por ácido a menudo ocurre entre pH 2 y 5, el despliegue inducido por base generalmente requiere un pH 10 o superior. [dieciséis]
Los ácidos nucleicos (incluidos el ARN y el ADN ) son polímeros de nucleótidos sintetizados por enzimas polimerasas durante la transcripción o la replicación del ADN . Después de la síntesis 5'-3' de la columna vertebral, las bases nitrogenadas individuales son capaces de interactuar entre sí mediante enlaces de hidrógeno , permitiendo así la formación de estructuras de orden superior. La desnaturalización del ácido nucleico ocurre cuando se rompe el enlace de hidrógeno entre nucleótidos y da como resultado la separación de hebras previamente hibridadas . Por ejemplo, la desnaturalización del ADN debido a altas temperaturas da como resultado la alteración de los pares de bases y la separación de la hélice bicatenaria en dos hebras simples. Las hebras de ácido nucleico son capaces de volver a hibridarse cuando se restablecen las condiciones " normales ", pero si la restauración se produce demasiado rápido, las hebras de ácido nucleico pueden volver a hibridarse de manera imperfecta, lo que da como resultado un emparejamiento inadecuado de bases.
Las interacciones no covalentes entre cadenas antiparalelas del ADN se pueden romper para "abrir" la doble hélice cuando se produzcan mecanismos biológicamente importantes como la replicación del ADN, la transcripción, la reparación del ADN o la unión a proteínas. [17] El área de ADN parcialmente separado se conoce como burbuja de desnaturalización, que puede definirse más específicamente como la apertura de una doble hélice de ADN mediante la separación coordinada de pares de bases. [17]
El primer modelo que intentó describir la termodinámica de la burbuja de desnaturalización se introdujo en 1966 y se denominó modelo Polonia-Scheraga. Este modelo describe la desnaturalización de las cadenas de ADN en función de la temperatura . A medida que aumenta la temperatura, los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases se alteran cada vez más y comienzan a formarse "bucles desnaturalizados". [18] Sin embargo, el modelo Polonia-Scheraga ahora se considera elemental porque no tiene en cuenta las implicaciones confusas de la secuencia del ADN , la composición química, la rigidez y la torsión . [19]
Estudios termodinámicos recientes han inferido que la vida útil de una burbuja de desnaturalización singular oscila entre 1 microsegundo y 1 milisegundo. [20] Esta información se basa en escalas de tiempo establecidas de replicación y transcripción del ADN. [20] Actualmente, [ ¿cuándo? ] Se están realizando estudios de investigación biofísica y bioquímica para dilucidar más completamente los detalles termodinámicos de la burbuja de desnaturalización. [20]
Dado que la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se encuentra entre los contextos más populares en los que se desea la desnaturalización del ADN, el calentamiento es el método de desnaturalización más frecuente. [21] Además de la desnaturalización por calor, los ácidos nucleicos pueden sufrir el proceso de desnaturalización a través de diversos agentes químicos como formamida , guanidina , salicilato de sodio , dimetilsulfóxido (DMSO), propilenglicol y urea . [22] Estos agentes químicos desnaturalizantes reducen la temperatura de fusión (Tm ) al competir por los donantes y aceptores de enlaces de hidrógeno con pares de bases nitrogenadas preexistentes . Algunos agentes incluso pueden inducir la desnaturalización a temperatura ambiente. Por ejemplo, se ha demostrado que los agentes alcalinos (por ejemplo, NaOH) desnaturalizan el ADN cambiando el pH y eliminando los protones que contribuyen al enlace de hidrógeno. [21] Estos desnaturalizantes se han empleado para fabricar gel de electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE), que promueve la desnaturalización de los ácidos nucleicos para eliminar la influencia de la forma del ácido nucleico en su movilidad electroforética . [23]
La actividad óptica (absorción y dispersión de la luz) y las propiedades hidrodinámicas ( difusión traslacional , coeficientes de sedimentación y tiempos de correlación rotacional ) de los ácidos nucleicos desnaturalizados con formamida son similares a las de los ácidos nucleicos desnaturalizados por calor. [22] [24] [25] Por lo tanto, dependiendo del efecto deseado, la desnaturalización química del ADN puede proporcionar un procedimiento más suave para desnaturalizar los ácidos nucleicos que la desnaturalización inducida por calor. Los estudios que comparan diferentes métodos de desnaturalización, como calentamiento, molino de perlas de diferentes tamaños, sonicación con sonda y desnaturalización química, muestran que la desnaturalización química puede proporcionar una desnaturalización más rápida en comparación con los otros métodos de desnaturalización física descritos. [21] Particularmente en los casos en los que se desea una renaturalización rápida, los agentes de desnaturalización química pueden proporcionar una alternativa ideal al calentamiento. Por ejemplo, las cadenas de ADN desnaturalizadas con agentes alcalinos como NaOH se renaturalizan tan pronto como se agrega tampón fosfato . [21]
Las moléculas pequeñas y electronegativas , como el nitrógeno y el oxígeno , que son los gases primarios del aire , afectan significativamente la capacidad de las moléculas circundantes para participar en los enlaces de hidrógeno . [26] Estas moléculas compiten con los aceptores de enlaces de hidrógeno circundantes por los donantes de enlaces de hidrógeno, por lo que actúan como "rompedores de enlaces de hidrógeno" y debilitan las interacciones entre las moléculas circundantes en el medio ambiente. [26] Las hebras antiparelelas en las dobles hélices de ADN están unidas de forma no covalente mediante enlaces de hidrógeno entre pares de bases; [27] Por lo tanto, el nitrógeno y el oxígeno mantienen el potencial de debilitar la integridad del ADN cuando se exponen al aire. [28] Como resultado, las hebras de ADN expuestas al aire requieren menos fuerza para separarse y ejemplifican temperaturas de fusión más bajas . [28]
Muchas técnicas de laboratorio se basan en la capacidad de separación de las cadenas de ácidos nucleicos. Al comprender las propiedades de la desnaturalización del ácido nucleico, se crearon los siguientes métodos:
Los desnaturalizantes de proteínas ácidas incluyen:
Las bases funcionan de manera similar a los ácidos en la desnaturalización. Incluyen:
La mayoría de los disolventes orgánicos son desnaturalizantes, incluidos: [ cita necesaria ]
Los agentes reticulantes para proteínas incluyen: [ cita necesaria ]
Los agentes caotrópicos incluyen: [ cita necesaria ]
Los agentes que rompen los enlaces disulfuro por reducción incluyen: [ cita necesaria ]
Agentes como el peróxido de hidrógeno, el cloro elemental, el ácido hipocloroso (agua con cloro), el bromo, el agua con bromo, el yodo, los ácidos nítrico y oxidante y el ozono reaccionan con fracciones sensibles como el sulfuro/tiol, los anillos aromáticos activados (fenilalanina) dañan de hecho la proteína y volverla inútil.
Los desnaturalizantes ácidos de ácidos nucleicos incluyen:
Los desnaturalizantes de ácidos nucleicos básicos incluyen:
Otros desnaturalizantes de ácidos nucleicos incluyen:
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