Secuenciación del ADN
Además, se puede utilizar la secuenciación del ADN para conocer las mutaciones somáticas, como las sustituciones de bases, generadas entre distintos organismos.
Los agentes químicos utilizados en cada caso son: dimetilsulfato, o DMS (A+G), ácido fórmico (A), hidrazina (C+T) e hidrazina más sales (C).De ese modo se genera una serie de fragmentos marcados a partir del final marcado radiactivamente hasta el primer lugar de "corte" en cada molécula.
En cada reacción se añade solo uno de los cuatro didesoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP, o ddTTP).
Como alternativa se puede utilizar un cebador marcado en el extremo 5' mediante un colorante fluorescente.
Se siguen necesitando cuatro reacciones, pero los fragmentos de ADN marcados con colorantes se pueden leer utilizando un sistema óptico, lo que facilita un análisis más rápido y económico y su automatización.
Esta variante se conoce como "secuenciación mediante colorantes acoplados al cebador" (dye-primer sequencing).
Dicho compuesto actúa desaminando las citosinas no metiladas del ADN convirtiéndolas en uracilo.
El siguiente paso consiste en la amplificación de la fracción B y su posterior secuenciación.
Estas variaciones nos indican que en la cadena de ADN original, la citosina no estaba metilada.
La adición de uno o varios nucleótidos resulta en una reacción que genera una señal verde y es grabada por la cámara CCD.
Sin embargo, hoy se puede realizar mediante software como "Fast Chromatogram Viewer" el arreglo automático de los extremos terminales en grandes cantidades.
Así pues, algunos enfoques abordan el problema cortando (con enzimas de restricción) o cizallando (mediante fuerzas mecánicas) fragmentos grandes para obtener otros más pequeños.
Todas estas estrategias implican efectuar muchas lecturas menores del ADN por alguno de los métodos anteriores y posteriormente ensamblarlos en secuencias contiguas.
La secuencia resultante se compara con la de referencia o con una muestra normal para detectar mutaciones.
Son las llamadas también secuenciaciones de nueva generación o "next-generation sequencing" (NGS).
Los clones expandidos con estas mutaciones conductoras, que a menudo se producen en los genes asociados al cáncer, tienen una mayor probabilidad de adquirir mutaciones patógenas y, por tanto, tienen implicaciones para el riesgo de cáncer.
Tras cada ciclo, se lavan los nucleótidos para añadir un nuevo tipo, y la reacción se volverá a producir o no dependiendo de la secuencia los nucleótidos de la cadena a secuenciar.
En caso de que haya dos o más bases iguales consecutivas, se incorporarán múltiples nucleótidos en un único ciclo, se liberarán más átomos de hidrógeno y la señal electrónica será proporcionalmente mayor.
[28][24][25] Se usa en el método polony y en la tecnología SOLiD que ofrece Applied Biosystems.
Esto la hace especialmente adecuada para resolver problemas complejos en investigaciones de genomas, transcriptomas y epigenética.
Una vez ha sacado una foto de toda la superficie, la micro-placa es tratada con una solución cuyos componentes producen la escisión del fluoróforo unido a la última adenina.
Entonces, la polimerasa cataliza su incorporación al cebador en aquellos casos donde corresponda, según la secuencia del fragmento concreto.
Un software analiza dichas imágenes y reconstruye las secuencias de cada fragmento, las cuales deben ser ensambladas posteriormente por programas informáticos.
El proceso de secuenciación es más rápido debido a que no es necesario lavar nucleótidos ni enzimas.
La metilación del ADN se ha realizado por mucho tiempo mediante técnicas que se tienen como principal fundamento la conversión química o enzimática, hibridación en arrays de metilación y secuenciación del genoma completo (WGBS); estas técnicas son costosas y limitadas, por lo cual RIMS-seq2 es una nueva técnica que tiene como principal fin simplificar el análisis simultáneo del genoma y del metiloma, siendo esto posible a través de la desaminación química controlada de la 5-metilcitosina (m5C), donde se realiza un tratamiento alcalino térmico limitado que produce la desaminación de una fracción de m5C.
La metilación del ADN implica la transferencia de un grupo metilo a la posición C5 de la citosina para formar 5-metilcitosina, se considera un mecanismo epigenético, su regulación es esencial para la función cognitiva normal.
[36] Hay nuevas propuestas para la secuenciación de ADN que están en desarrollo, pero aún no han sido probadas.
En octubre de 2006, la Fundación Premio X estableció el Premio Arconte X (Archon X Prize), que premia con 10 millones de dólares al "primer equipo que pueda construir un dispositivo y utilizarlo para secuenciar 100 genomas humanos en 10 días o menos, con una exactud no menor a un error por cada 100 000 bases secuenciadas, con secuencias que cubran correctamente al menos el 98 % del genoma, y a un coste no mayor de 1000 dólares por genoma.
Existen distintos GIV, aunque por consenso general el más utilizado es el que mide el desbalance entre G>T/C>A.
Durante esta amplificación, el daño oxidativo se corrige pero de manera errónea, sustituyéndose las guaninas dañadas por timinas que a su vez serán emparejadas con adeninas, dando lugar a dos hebras teóricamente correctas (sin daño aparente), pero distintas y no complementarias, entre las que existe un desbalance, este desbalance es el GIV.
