Pirosecuenciación

A partir del pirofosfato se generará luz por medio de diversas reacciones enzimáticas en cadena.

En el tubo de reacción se encontrarán las enzimas luciferasa, ATP sulfurilasa, ADN polimerasa y apirasa además de los sustratos luciferina y adenosín-5-fosfosulfato (APS).

A continuación se añaden los nucleótidos uno después del otro, al contrario que en una reacción de secuenciación normal donde se añaden todos a la vez.

En el caso de no conocer la secuencia en particular, la máquina va liberando por orden las bases A, T, G, C. El resultado nos otorgará un patrón de picos que tendremos que interpretar.

Esto se debe a que la señal luminosa generada es proporcional al número de nucleótidos incorporados, pero no siempre es lineal, lo que provoca errores en la cuantificación.

How Pyrosequencing Works
Funcionamiento de la pirosecuenciación.
Ejemplo de pirogramas. a) Pirosecuenciación de secuencia desconocida utilizando los nucleótidos por orden y de forma automatizada. b) Detección de SNPs utilizando pirosecuenciación, en el gráfico de la izquierda se observa el pirograma utilizando los nucleótidos de la secuencia conocida, en el de la derecha se ha detectado el cambio de una G por una C empleando los mismos nucleótidos que en el anterior caso, el individuo estudiado sería homocigótico para dicho cambio de base