ADN ligasa
En este momento entran en acción las ADN ligasas para unir los extremos de esta nueva cadena.
Por un lado, en las células eucariotas y en las arqueas, la fuente de energía es el ATP (Adenosin Trifosfato).
La molécula de ATP se separa en AMP (Adenosin Monofosfato) y pirofosfato para facilitar la dirección.
Por otro lado, las bacterias obtienen la energía del NAD+ (nicotinamida adenina dinucleótido) el cual se divide en AMP y NMN (mononucleótido de nicotinamida) con la misma finalidad que lo hace el ATP de eucariotas y arqueas.
Como en muchos organismos procariotas, la ADN ligasa de esta bacteria usa la energía creada con el cofactor NAD para formar los enlaces fosfodiéster.
En los mamíferos, se pueden determinar hasta 4 clases de ADN ligasas cuyo substrato principal es ATP.
En el dominio del grupo amino terminal no catalítico se localiza el centro activo de esta enzima.
Estas enzimas se diferencian por su habilidad de unirse a la proteína reparadora del ADN, XRCC1.
Por otro lado la beta-ADN ligasa III parece ayudar en la finalización de la recombinación meiótica o en la reparación del ADN postmeiosis.
Para realizar este tipo de experimentos se debe controlar sobre todo la temperatura.
El siguiente paso en la preparación de la genoteca consiste en introducir las moléculas circulares de ADN recombinante en bacterias temporalmente permeables al ADN; se dice que estas células han sido transfectadas con el plásmido.
A medida que estas células van creciendo y dividiéndose - duplican su número cada 30 minutos- los plásmidos recombinantes también se van replicando y produciendo un número enorme de copias de ADN circulantes que contienen ADN ajeno.
La ADN ligasa IV y XLF se requieren para todos los eventos NHEJ.
Todos los ratones NHEJ mutantes muestran un fenotipo SCID, la sensibilidad a la radiación ionizante, y la apoptosis neuronal.
