[3] Botto estudió interpretación en la escuela fundada por su madre en Madrid, germen del posterior Centro de Nuevos Creadores, con sede en la Sala Mirador, por donde han pasado algunos de los mejores actores y actrices españoles.
Más tarde se trasladó a Nueva York para continuar sus estudios bajo la dirección de Uta Hagen.
Tres años después protagoniza la película Historias del Kronen, de Montxo Armendáriz, con la que alcanzó gran éxito y popularidad.
Juan Diego Botto obtuvo en 2014 los Premios Max de Teatro a Mejor Actor y Mejor Autor Revelación por dicha obra, que se hizo además con el Premio Max a Mejor Obra del año.
Ha sido cuatro veces nominado a los Premios Goya por sus participaciones en las películas Historias del Kronen, Plenilunio (2000), Vete de mí (2006) e Ismael (2013), respectivamente.
[25] En octubre de 2022 estrena su primer largometraje como director, titulado En los márgenes con Penélope Cruz y Luis Tosar como protagonistas.