Decidió ser actriz para poder llegar a cumplir un sueño: trabajar algún día con Pedro Almodóvar.

La primera aparición interpretativa de Penélope Cruz fue en 1989 en el videoclip de la canción La fuerza del destino del grupo pop Mecano, tema publicado en 1988 en el disco "Descanso dominical", cuando tan solo tenía 14 años.

Tras una exhaustiva búsqueda entre más de 200 chicas, Cruz quedó seleccionada para ser la protagonista del videoclip.

En ella compartió reparto con actores como Maribel Verdú, Ariadna Gil, Jorge Sanz, Agustín González, Chus Lampreave o Fernando Fernán Gómez entre muchos otros.

En 1996 le surgieron dos grandes oportunidades: protagonizar La Celestina, dirigida por Gerardo Vera, en la que trabajó con Terele Pávez, Juan Diego Botto y Maribel Verdú entre otros actores y la comedia romántica El amor perjudica seriamente la salud, de Manuel Gómez Pereira.

Fue en Carne trémula, protagonizada por Javier Bardem, Liberto Rabal, José Sancho y Ángela Molina entre otros actores.

El mismo año también protagonizó la película Abre los ojos, dirigida por Alejandro Amenábar donde actuó junto a Eduardo Noriega y Fele Martínez entre otros.

Fue un gran éxito de taquilla que la lanzó a la fama y al prestigio nacional.

Con estas tres películas y reconocida en el cine español, empezó a darse a conocer en el mercado internacional al ser nominada como mejor actriz protagonista por La niña de tus ojos en los Premios del cine europeo.

En la cinta compartió cartel junto a Daniel Day-Lewis, Marion Cotillard, Sophia Loren, Judi Dench y Nicole Kidman además de Kate Hudson.

[14]​ El mismo año se estrenó Sex and the City 2, donde Penélope Cruz hizo un pequeño papel, interpretando a Carmen, una banquera.

Por las mismas fechas rodó nuevamente con Woody Allen; en esta ocasión, un papel más secundario en To Rome with Love, película con un extenso reparto que incluye a Alec Baldwin, Roberto Benigni y Ornella Muti.

Filmó también la película The Counselor de Ridley Scott, con su marido Javier Bardem, Cameron Diaz, Brad Pitt y Michael Fassbender.

En 2016 se estrenó la segunda película de la taquillera saga Zoolander, donde Penélope Cruz tiene un papel destacado junto a los protagonistas Owen Wilson y Ben Stiller.

En 2017 la actriz española ha tenido mejor suerte, al obtener un papel destacado en Murder on the Orient Express de Kenneth Branagh, donde se codea con estrellas como Johnny Depp, Michelle Pfeiffer, Willem Dafoe y Judi Dench.

Las películas más taquilleras en las que aparece en reparto son Piratas del Caribe, G-Force,Vanilla Sky, Gothika, Sahara, Vicky Cristina Barcelona, Volver y Blow.

[22]​ Penélope Cruz ha sido imagen comercial de diversas marcas, como Coca-Cola, L'Oréal o Nintendo.

En 2019 desfiló en el Grand Palais sobre la pasarela de la firma francesa en homenaje al fallecido Karl Lagerfeld.

Una colaboración suya aparece en el disco Voices of hope de la Fundación Sabera, en donde canta a dúo con Joan Manuel Serrat la canción por la que fue bautizada así, «Penélope», y en la comedia musical Nine interpreta el tema «A call from the Vatican».

[30]​ Entre su círculo íntimo de amistades se encuentran Pedro Almodóvar, Goya Toledo, Antonio Banderas, Johnny Depp y Salma Hayek, entre otros.