Los proteosomas son complejos proteicos que degradan proteínas innecesarias o dañadas mediante proteólisis , una reacción química que rompe los enlaces peptídicos . Las enzimas que ayudan a tales reacciones se llaman proteasas .
Los proteosomas son parte de un mecanismo importante por el cual las células regulan la concentración de proteínas particulares y degradan las proteínas mal plegadas . Las proteínas se marcan para su degradación con una pequeña proteína llamada ubiquitina . La reacción de marcado es catalizada por enzimas llamadas ubiquitina ligasas . Una vez que una proteína se marca con una sola molécula de ubiquitina, esto es una señal para que otras ligasas unan moléculas de ubiquitina adicionales. El resultado es una cadena de poliubiquitina unida al proteosoma, lo que le permite degradar la proteína marcada. [1] El proceso de degradación produce péptidos de aproximadamente siete a ocho aminoácidos de largo, que luego pueden degradarse aún más en secuencias de aminoácidos más cortas y usarse para sintetizar nuevas proteínas. [1]
Los proteosomas se encuentran dentro de todos los eucariotas y arqueas , y en algunas bacterias . En los eucariotas, los proteosomas se encuentran tanto en el núcleo como en el citoplasma . [2]
En estructura , el proteosoma es un complejo cilíndrico que contiene un "núcleo" de cuatro anillos apilados que forman un poro central. Cada anillo está compuesto por siete proteínas individuales. Los dos anillos internos están formados por siete subunidades β que contienen de tres a siete sitios activos de proteasa . Estos sitios están ubicados en la superficie interior de los anillos, de modo que la proteína objetivo debe ingresar al poro central antes de degradarse. Los dos anillos exteriores contienen cada uno siete subunidades α cuya función es mantener una "puerta" a través de la cual las proteínas ingresan al barril. Estas subunidades α se controlan mediante la unión a estructuras de "tapa" o partículas reguladoras que reconocen etiquetas de poliubiquitina adheridas a sustratos proteicos e inician el proceso de degradación. El sistema general de ubiquitinación y degradación proteasómica se conoce como sistema ubiquitina-proteosoma . [3]
La vía de degradación proteasomal es esencial para muchos procesos celulares, incluido el ciclo celular , la regulación de la expresión genética y las respuestas al estrés oxidativo . La importancia de la degradación proteolítica dentro de las células y el papel de la ubiquitina en las vías proteolíticas fue reconocida en la concesión del Premio Nobel de Química de 2004 a Aaron Ciechanover , Avram Hershko e Irwin Rose . [4]
Antes del descubrimiento del sistema ubiquitina-proteasoma, se pensaba que la degradación de proteínas en las células dependía principalmente de los lisosomas , orgánulos unidos a membranas con interiores ácidos y llenos de proteasas que pueden degradar y luego reciclar proteínas exógenas y orgánulos envejecidos o dañados. [1] Sin embargo, el trabajo de Joseph Etlinger y Alfred L. Goldberg en 1977 sobre la degradación de proteínas dependiente de ATP en reticulocitos , que carecen de lisosomas, sugirió la presencia de un segundo mecanismo de degradación intracelular. [5] En 1978 se demostró que estaba compuesto por varias cadenas de proteínas distintas, una novedad entre las proteasas de la época. [6] El trabajo posterior sobre la modificación de histonas condujo a la identificación de una modificación covalente inesperada de la proteína histona mediante un enlace entre una cadena lateral de lisina de la histona y el residuo de glicina C-terminal de la ubiquitina , una proteína que no tenía ninguna función conocida. . [7] Luego se descubrió que una proteína previamente identificada asociada con la degradación proteolítica, conocida como factor de proteólisis dependiente de ATP 1 (APF-1), era la misma proteína que la ubiquitina. [8] Las actividades proteolíticas de este sistema fueron aisladas como un complejo multiproteico originalmente llamado complejo de proteinasa multicatalítica por Sherwin Wilk y Marion Orlowski. [9] Más tarde, se descubrió el complejo proteolítico dependiente de ATP que era responsable de la degradación de proteínas dependiente de ubiquitina y se llamó proteosoma 26S. [10] [11]
Gran parte de los primeros trabajos que condujeron al descubrimiento del sistema proteosoma de ubiquitina se produjeron a finales de los años 1970 y principios de los años 1980 en el Technion , en el laboratorio de Avram Hershko , donde Aaron Ciechanover trabajaba como estudiante de posgrado. El año sabático de Hershko en el laboratorio de Irwin Rose en el Centro Oncológico Fox Chase proporcionó ideas conceptuales clave, aunque más tarde Rose minimizó su papel en el descubrimiento. [12] Los tres compartieron el Premio Nobel de Química de 2004 por su trabajo en el descubrimiento de este sistema. [4]
Aunque los datos de microscopía electrónica que revelaban la estructura de anillos apilados del proteasoma estuvieron disponibles a mediados de la década de 1980, [13] la primera estructura de la partícula central del proteosoma no se resolvió mediante cristalografía de rayos X hasta 1994. [14] En 2018, el Las primeras estructuras atómicas de la holoenzima del proteosoma 26S humano en complejo con un sustrato proteico poliubiquitilado se resolvieron mediante microscopía electrónica criogénica , revelando mecanismos mediante los cuales el proteosoma 26S humano reconoce, desubiquitila, despliega y degrada el sustrato. [15]
Los subcomponentes del proteasoma a menudo se denominan por su coeficiente de sedimentación de Svedberg (denotado S ). El proteasoma más utilizado exclusivamente en mamíferos es el proteasoma citosólico 26S, que tiene aproximadamente 2000 kilodaltons (kDa) de masa molecular y contiene una subunidad proteica 20S y dos subunidades de tapa reguladora 19S. El núcleo es hueco y proporciona una cavidad cerrada en la que se degradan las proteínas; Las aberturas en los dos extremos del núcleo permiten la entrada de la proteína objetivo. Cada extremo de la partícula central se asocia con una subunidad reguladora 19S que contiene múltiples sitios activos de ATPasa y sitios de unión de ubiquitina; es esta estructura la que reconoce las proteínas poliubiquitinadas y las transfiere al núcleo catalítico. [15] Una forma alternativa de subunidad reguladora llamada partícula 11S puede asociarse con el núcleo esencialmente de la misma manera que la partícula 19S; El 11S puede desempeñar un papel en la degradación de péptidos extraños, como los producidos después de una infección por un virus . [dieciséis]
El número y la diversidad de subunidades contenidas en la partícula central 20S depende del organismo; el número de subunidades distintas y especializadas es mayor en los organismos multicelulares que en los unicelulares y mayor en los eucariotas que en los procariotas. Todas las partículas 20S constan de cuatro estructuras de anillos heptaméricos apilados que a su vez están compuestos por dos tipos diferentes de subunidades; Las subunidades α son de naturaleza estructural, mientras que las subunidades β son predominantemente catalíticas . Las subunidades α son pseudoenzimas homólogas a las subunidades β. Se ensamblan con sus extremos N adyacentes a los de las subunidades β. [17] Los dos anillos exteriores de la pila constan de siete subunidades α cada uno, que sirven como dominios de acoplamiento para las partículas reguladoras y las subunidades alfa N-terminales ( Pfam PF10584) forman una puerta que bloquea el acceso no regulado de los sustratos a la cavidad interior. . [18] Los dos anillos internos constan cada uno de siete subunidades β y en sus extremos N contienen los sitios activos de proteasa que realizan las reacciones de proteólisis. [19] Se identificaron tres actividades catalíticas distintas en el complejo purificado: tipo quimotripsina, tipo tripsina y peptidilglutamil-péptido hidrolizante. [20] El tamaño del proteasoma está relativamente conservado y es de aproximadamente 150 angstroms (Å) por 115 Å. La cámara interior tiene como máximo 53 Å de ancho, aunque la entrada puede ser tan estrecha como 13 Å, lo que sugiere que las proteínas del sustrato deben estar al menos parcialmente desplegadas para entrar. [21]
En arqueas como Thermoplasma acidophilum , todas las subunidades α y β son idénticas, mientras que los proteasomas eucariotas como los de la levadura contienen siete tipos distintos de cada subunidad. En los mamíferos , las subunidades β1, β2 y β5 son catalíticas; aunque comparten un mecanismo común, tienen tres especificidades de sustrato distintas consideradas similares a la quimotripsina , similares a la tripsina y peptidil-glutamil péptido hidrolizante (PHGH). [22] Las formas β alternativas denominadas β1i, β2i y β5i pueden expresarse en células hematopoyéticas en respuesta a la exposición a señales proinflamatorias como las citocinas , en particular el interferón gamma . El proteasoma ensamblado con estas subunidades alternativas se conoce como inmunoproteasoma , cuya especificidad de sustrato está alterada en relación con el proteasoma normal. [21] Recientemente se identificó un proteosoma alternativo en células humanas que carecen de la subunidad central α3. [23] Estos proteosomas (conocidos como proteosomas α4-α4) forman partículas centrales 20S que contienen una subunidad α4 adicional en lugar de la subunidad α3 faltante. Se sabía previamente que estos proteosomas alternativos 'α4-α4' existían en la levadura. [24] Aunque la función precisa de estas isoformas de proteosomas aún se desconoce en gran medida, las células que expresan estos proteosomas muestran una mayor resistencia a la toxicidad inducida por iones metálicos como el cadmio. [23] [25]
La partícula 19S en eucariotas consta de 19 proteínas individuales y es divisible en dos subconjuntos, una base de 9 subunidades que se une directamente al anillo α de la partícula central 20S y una tapa de 10 subunidades. Seis de las nueve proteínas base son subunidades de ATPasa de la familia AAA, y existe un homólogo evolutivo de estas ATPasas en las arqueas, llamado PAN (nucleotidasa activadora de proteasoma). [26] La asociación de las partículas 19S y 20S requiere la unión de ATP a las subunidades de ATPasa 19S, y se requiere la hidrólisis de ATP para que el complejo ensamblado degrade las proteínas plegadas y ubiquitinadas. Tenga en cuenta que sólo el paso de desarrollo del sustrato requiere energía de la hidrólisis del ATP, mientras que la unión de ATP por sí sola puede respaldar todos los demás pasos necesarios para la degradación de proteínas (p. ej., ensamblaje complejo, apertura de compuerta, translocación y proteólisis). [27] [28] De hecho, la unión del ATP a las ATPasas por sí sola favorece la rápida degradación de las proteínas desplegadas. Sin embargo, si bien la hidrólisis del ATP se requiere únicamente para el desarrollo, aún no está claro si esta energía puede usarse en el acoplamiento de algunos de estos pasos. [28] [29]
En 2012, dos esfuerzos independientes dilucidaron la arquitectura molecular del proteosoma 26S mediante microscopía electrónica de partícula única . [31] [32] En 2016, tres esfuerzos independientes determinaron la primera estructura de resolución casi atómica del proteosoma 26S humano en ausencia de sustratos mediante crio-EM. [33] [34] [35] En 2018, un gran esfuerzo ha dilucidado los mecanismos detallados de desubiquitilación, inicio de translocación y despliegue procesivo de sustratos mediante la determinación simultánea de siete estructuras atómicas del proteasoma 26S acoplado a sustrato. [15] En el corazón del 19S, directamente adyacente al 20S, se encuentran las AAA-ATPasas ( proteínas AAA ) que se ensamblan en un anillo heterohexámero del orden Rpt1/Rpt2/Rpt6/Rpt3/Rpt4/Rpt5. Este anillo es un trímero de dímeros: Rpt1/Rpt2, Rpt6/Rpt3 y Rpt4/Rpt5 se dimerizan a través de sus espirales N-terminales. Estas bobinas sobresalen del anillo hexámero. Las partículas reguladoras más grandes, no ATPasas, Rpn1 y Rpn2, se unen a las puntas de Rpt1/2 y Rpt6/3, respectivamente. El receptor de ubiquitina Rpn13 se une a Rpn2 y completa el subcomplejo de bases. La tapa cubre la mitad del hexámero AAA-ATPasa (Rpt6/Rpt3/Rpt4) y, inesperadamente, contacta directamente con el 20S a través de Rpn6 y, en menor medida, Rpn5. Las subunidades Rpn9, Rpn5, Rpn6, Rpn7, Rpn3 y Rpn12, que están estructuralmente relacionadas entre sí y con las subunidades del complejo COP9 y eIF3 (de ahí que se llamen subunidades PCI), se ensamblan en una estructura en forma de herradura que encierra el heterodímero Rpn8/Rpn11. Rpn11, la enzima desubiquitinante , se coloca en la boca del hexámero AAA-ATPasa, en una posición ideal para eliminar restos de ubiquitina inmediatamente antes de la translocación de sustratos al 20S. El segundo receptor de ubiquitina identificado hasta la fecha, Rpn10, está situado en la periferia del párpado, cerca de las subunidades Rpn8 y Rpn9.
La partícula reguladora 19S dentro de la holoenzima del proteosoma 26S se ha observado en seis estados conformacionales muy diferentes en ausencia de sustratos hasta la fecha. [36] [37] Un sello distintivo de la configuración AAA-ATPasa en este estado predominante de baja energía es una disposición en forma de escalera o arandela de seguridad de los dominios AAA. [30] [31] En presencia de ATP pero en ausencia de sustrato, se adoptan tres conformaciones alternativas, menos abundantes, del 19S que difieren principalmente en la posición de la tapa con respecto al módulo AAA-ATPasa. [33] [37] En presencia de ATP-γS o un sustrato, se han observado muchas más conformaciones que muestran cambios estructurales dramáticos del módulo AAA-ATPasa. [15] [36] [38] [39] Algunas de las conformaciones unidas al sustrato tienen una gran similitud con las libres de sustrato, pero no son completamente idénticas, particularmente en el módulo AAA-ATPasa. [15] [36] Antes del ensamblaje del 26S, la partícula reguladora 19S en forma libre también se ha observado en siete estados conformacionales. [40] En particular, todos estos conformadores son algo diferentes y presentan características distintas. Por tanto, la partícula reguladora 19S puede muestrear al menos 20 estados conformacionales en diferentes condiciones fisiológicas.
La partícula reguladora 19S se encarga de estimular la 20S para degradar las proteínas. Una función principal de las ATPasas reguladoras del 19S es abrir la puerta del 20S que bloquea la entrada de sustratos a la cámara de degradación. [41] Recientemente se ha dilucidado el mecanismo por el cual la ATPasa proteasomal abre esta puerta. [18] La apertura de la puerta 20S y, por tanto, la degradación del sustrato, requiere los extremos C de las ATPasas proteasómicas, que contienen un motivo específico (es decir, el motivo HbYX). Los extremos C de las ATPasas se unen a bolsas en la parte superior del 20S y unen el complejo de ATPasa al complejo proteolítico 20S, uniendo así el equipo de despliegue del sustrato con la maquinaria de degradación del 20S. La unión de estos C-termini en estos bolsillos 20S por sí mismos estimula la apertura de la puerta en los 20S de manera muy similar a como una "llave en una cerradura" abre una puerta. [18] El mecanismo preciso por el cual funciona este mecanismo de "llave en cerradura" se ha dilucidado estructuralmente en el contexto del proteosoma 26S humano con resolución casi atómica, lo que sugiere que la inserción de cinco extremos C de las subunidades de ATPasa Rpt1 /2/3/5/6 en los bolsillos de la superficie 20S son necesarios para abrir completamente la puerta 20S. [36] [15] [33]
Los proteosomas 20S también pueden asociarse con un segundo tipo de partícula reguladora, la partícula reguladora 11S, una estructura heptamérica que no contiene ATPasas y puede promover la degradación de péptidos cortos pero no de proteínas completas. Se supone que esto se debe a que el complejo no puede desplegar sustratos más grandes. Esta estructura también se conoce como PA28, REG o PA26. [17] Los mecanismos por los cuales se une a la partícula central a través de las colas C-terminales de sus subunidades e induce cambios conformacionales del anillo α para abrir la puerta 20S sugieren un mecanismo similar para la partícula 19S. [42] La expresión de la partícula 11S es inducida por interferón gamma y es responsable, junto con las subunidades β del inmunoproteasoma, de la generación de péptidos que se unen al complejo mayor de histocompatibilidad . [dieciséis]
Otro tipo más de partícula reguladora no ATPasa es Blm10 (levadura) o PA200/ PSME4 (humano). Abre sólo una subunidad α en la puerta 20S y se pliega formando una cúpula con un poro muy pequeño encima. [17]
El ensamblaje del proteosoma es un proceso complejo debido a la cantidad de subunidades que deben asociarse para formar un complejo activo. Las subunidades β se sintetizan con "propéptidos" N-terminales que se modifican postraduccionalmente durante el ensamblaje de la partícula 20S para exponer el sitio activo proteolítico. La partícula 20S se ensambla a partir de dos semiproteasomas, cada uno de los cuales consta de un anillo pro-β de siete miembros unido a un anillo α de siete miembros. La asociación de los anillos β de los dos semiproteosomas desencadena la autólisis de los propéptidos dependiente de treonina para exponer el sitio activo. Estas interacciones β están mediadas principalmente por puentes salinos e interacciones hidrofóbicas entre hélices alfa conservadas cuya alteración por mutación daña la capacidad de ensamblaje del proteasoma. [43] El ensamblaje de los semiproteasomas, a su vez, se inicia mediante el ensamblaje de las subunidades α en su anillo heptamérico, formando una plantilla para la asociación del correspondiente anillo pro-β. No se ha caracterizado el ensamblaje de las subunidades α. [44]
Sólo recientemente se ha aclarado en gran medida el proceso de ensamblaje de la partícula reguladora 19S. La partícula reguladora 19S se ensambla como dos subcomponentes distintos, la base y la tapa. El ensamblaje del complejo base se ve facilitado por cuatro acompañantes de ensamblaje , Hsm3/S5b, Nas2/p27, Rpn14/PAAF1 y Nas6/ gankyrin (nombres de levaduras/mamíferos). [45] Estas chaperonas de ensamblaje se unen a las subunidades AAA- ATPasa y su función principal parece ser garantizar el ensamblaje adecuado del anillo heterohexámero AAA- ATPasa . Hasta la fecha, todavía se debate si el complejo de base se ensambla por separado, si el ensamblaje está modelado por la partícula central 20S o si existen vías de ensamblaje alternativas. Además de las cuatro chaperonas de ensamblaje, la enzima desubiquitinante Ubp6/Usp14 también promueve el ensamblaje de bases, pero no es esencial. [46] La tapa se ensambla por separado en un orden específico y no requiere acompañantes de ensamblaje. [47]
Las proteínas son el objetivo de la degradación por parte del proteasoma con modificación covalente de un residuo de lisina que requiere reacciones coordinadas de tres enzimas . En el primer paso, una enzima activadora de ubiquitina (conocida como E1) hidroliza el ATP y adenilila una molécula de ubiquitina . Luego, esto se transfiere al residuo de cisteína del sitio activo de E1 junto con la adenililación de una segunda ubiquitina. [48] Esta ubiquitina adenililada luego se transfiere a una cisteína de una segunda enzima, la enzima conjugadora de ubiquitina (E2). En el último paso, un miembro de una clase muy diversa de enzimas conocidas como ubiquitina ligasas (E3) reconoce la proteína específica que se va a ubiquitinar y cataliza la transferencia de ubiquitina desde E2 a esta proteína objetivo. Una proteína objetivo debe marcarse con al menos cuatro monómeros de ubiquitina (en forma de cadena de poliubiquitina) antes de que la tapa del proteosoma la reconozca. [49] Por lo tanto, es el E3 el que confiere especificidad de sustrato a este sistema. [50] La cantidad de proteínas E1, E2 y E3 expresadas depende del organismo y el tipo de célula, pero hay muchas enzimas E3 diferentes presentes en los humanos, lo que indica que existe una gran cantidad de objetivos para el sistema de proteasoma de ubiquitina.
El mecanismo por el cual una proteína poliubiquitinada se dirige al proteosoma no se comprende completamente. Algunas instantáneas de alta resolución del proteasoma unido a una proteína poliubiquitinada sugieren que los receptores de ubiquitina podrían coordinarse con la deubiquitinasa Rpn11 para la focalización y participación inicial del sustrato. [15] Las proteínas receptoras de ubiquitina tienen un dominio N-terminal similar a la ubiquitina (UBL) y uno o más dominios asociados a ubiquitina (UBA). Los dominios UBL son reconocidos por las tapas del proteosoma 19S y los dominios UBA se unen a la ubiquitina mediante haces de tres hélices . Estas proteínas receptoras pueden acompañar a las proteínas poliubiquitinadas al proteosoma, aunque los detalles de esta interacción y su regulación no están claros. [51]
La proteína ubiquitina en sí tiene 76 aminoácidos de largo y recibió su nombre debido a su naturaleza ubicua, ya que tiene una secuencia altamente conservada y se encuentra en todos los organismos eucariotas conocidos. [52] Los genes que codifican la ubiquitina en eucariotas están dispuestos en repeticiones en tándem , posiblemente debido a las fuertes demandas de transcripción de estos genes para producir suficiente ubiquitina para la célula. Se ha propuesto que la ubiquitina es la proteína de evolución más lenta identificada hasta la fecha. [53] La ubiquitina contiene siete residuos de lisina a los que se puede ligar otra ubiquitina, lo que da como resultado diferentes tipos de cadenas de poliubiquitina. [54] Las cadenas en las que cada ubiquitina adicional está unida a la lisina 48 de la ubiquitina anterior tienen un papel en la focalización del proteosoma, mientras que otros tipos de cadenas pueden estar involucradas en otros procesos. [55] [56]
Las cadenas de ubiquitina conjugadas con una proteína destinada a la degradación proteasómica normalmente se eliminan mediante cualquiera de las tres enzimas desubiquitilantes asociadas al proteasoma (DUB), que son Rpn11, Ubp6/USP14 y UCH37. Este proceso recicla la ubiquitina y es esencial para mantener el depósito de ubiquitina en las células. [56] Rpn11 es una subunidad estequiométrica intrínseca de la partícula reguladora 19S y es esencial para la función del proteosoma 26S. La actividad DUB de Rpn11 aumenta en el proteosoma en comparación con su forma monomérica. La forma en que Rpn11 elimina una cadena de ubiquitina en bloque de un sustrato proteico fue capturada por una estructura atómica del proteasoma humano acoplado al sustrato en una conformación denominada EB . [15] Curiosamente, esta estructura también muestra cómo la actividad DUB se acopla al reconocimiento del sustrato por parte de la AAA-ATPasa proteasomal. A diferencia de Rpn11, USP14 y UCH37 son los DUB que no siempre están asociados con el proteosoma. En las células, se encontró que alrededor del 10-40% de los proteosomas tenían asociada USP14. Tanto Ubp6/USP14 como UCH37 son activados en gran medida por el proteosoma y exhiben una actividad DUB muy baja por sí solos. Una vez activado, se descubrió que USP14 suprime la función del proteasoma mediante su actividad DUB y al inducir vías paralelas de transiciones conformacionales del proteasoma, una de las cuales resultó prohibir directamente la inserción de sustrato en la AAA-ATPasa, como se observa intuitivamente mediante microscopía electrónica criogénica resuelta en el tiempo. . [57] Parece que USP14 regula la función del proteosoma en múltiples puntos de control compitiendo catalíticamente con Rpn11 y reprogramando alostéricamente los estados AAA-ATPasa, lo cual es bastante inesperado para un DUB. [57] Estas observaciones implican que la regulación del proteosoma puede depender de sus transiciones dinámicas de estados conformacionales.
Una vez que una proteína ha sido ubiquitinada, la partícula reguladora 19S la reconoce en un paso de unión dependiente de ATP. [15] [28] La proteína sustrato luego debe ingresar al interior de la subunidad 20S para entrar en contacto con los sitios activos proteolíticos. Debido a que el canal central de la partícula 20S es estrecho y está cerrado por las colas N-terminales de las subunidades del anillo α, los sustratos deben desplegarse al menos parcialmente antes de ingresar al núcleo. [15] El paso del sustrato desplegado al núcleo se llama translocación y ocurre necesariamente después de la desubiquitinación. [15] [28] Sin embargo, el orden en el que los sustratos se desubiquitinan y se desdoblan aún no está claro. [58] Cuál de estos procesos es el paso limitante de la velocidad en la reacción de proteólisis general depende del sustrato específico; para algunas proteínas, el proceso de desarrollo limita la velocidad, mientras que la desubiquitinación es el paso más lento para otras proteínas. [27] Se sugiere que el grado en que los sustratos deben desplegarse antes de la translocación es de alrededor de 20 residuos de aminoácidos por la estructura atómica del proteosoma 26S acoplado al sustrato en el estado compatible con la desubiquitilación, [15] pero con una estructura terciaria sustancial , y en interacciones no locales particulares, como los enlaces disulfuro , son suficientes para inhibir la degradación. [59] También se ha propuesto la presencia de segmentos de proteína intrínsecamente desordenados de tamaño suficiente, ya sea en el extremo de la proteína o internamente, para facilitar el inicio eficiente de la degradación. [60] [61]
La puerta formada por las subunidades α impide que péptidos de más de cuatro residuos entren en el interior de la partícula 20S. Las moléculas de ATP unidas antes del paso de reconocimiento inicial se hidrolizan antes de la translocación. Si bien se necesita energía para el despliegue del sustrato, no se requiere para la translocación. [27] [28] El proteasoma 26S ensamblado puede degradar proteínas desplegadas en presencia de un análogo de ATP no hidrolizable , pero no puede degradar proteínas plegadas, lo que indica que la energía de la hidrólisis del ATP se utiliza para el despliegue del sustrato. [27] El paso del sustrato desplegado a través de la puerta abierta se produce mediante difusión facilitada si la tapa de 19S está en estado unido a ATP. [62]
El mecanismo de despliegue de las proteínas globulares es necesariamente general, pero en cierta medida depende de la secuencia de aminoácidos . Se ha demostrado que secuencias largas de glicina y alanina alternas inhiben el desarrollo del sustrato, lo que disminuye la eficiencia de la degradación proteasomal; esto da como resultado la liberación de subproductos parcialmente degradados, posiblemente debido al desacoplamiento de las etapas de hidrólisis y desarrollo del ATP. [63] Estas repeticiones de glicina-alanina también se encuentran en la naturaleza, por ejemplo en la fibroína de seda ; en particular, ciertos productos genéticos del virus de Epstein-Barr que llevan esta secuencia pueden detener el proteosoma, lo que ayuda a que el virus se propague al prevenir la presentación de antígenos en el complejo mayor de histocompatibilidad. [64]
El proteosoma funciona como una endoproteasa . [65] [66] [67] [68] El mecanismo de proteólisis por las subunidades β de la partícula central 20S es a través de un ataque nucleofílico dependiente de treonina . Este mecanismo puede depender de una molécula de agua asociada para la desprotonación del hidroxilo de treonina reactivo . La degradación ocurre dentro de la cámara central formada por la asociación de los dos anillos β y normalmente no libera productos parcialmente degradados, sino que reduce el sustrato a polipéptidos cortos que generalmente tienen de 7 a 9 residuos de largo, aunque pueden variar de 4 a 25 residuos, dependiendo de el organismo y el sustrato. El mecanismo bioquímico que determina la longitud del producto no está completamente caracterizado. [69] Aunque las tres subunidades β catalíticas tienen un mecanismo común, tienen especificidades de sustrato ligeramente diferentes, que se consideran similares a la quimotripsina, a la tripsina y al péptido hidrolizante de peptidil-glutamil (PHGH). Estas variaciones en la especificidad son el resultado de contactos interatómicos con residuos locales cerca de los sitios activos de cada subunidad. Cada subunidad β catalítica también posee un residuo de lisina conservado necesario para la proteólisis. [22]
Aunque el proteosoma normalmente produce fragmentos peptídicos muy cortos, en algunos casos estos productos son en sí mismos moléculas biológicamente activas y funcionales. Ciertos factores de transcripción que regulan la expresión de genes específicos, incluido un componente del complejo de mamíferos NF-κB , se sintetizan como precursores inactivos cuya ubiquitinación y posterior degradación proteasómica los convierte en una forma activa. Tal actividad requiere que el proteosoma escinda internamente la proteína sustrato, en lugar de degradarla procesivamente desde un extremo. Se ha sugerido que los bucles largos en las superficies de estas proteínas sirven como sustratos proteasómicos y entran en la cavidad central, mientras que la mayor parte de la proteína permanece afuera. [70] Se han observado efectos similares en las proteínas de levadura; este mecanismo de degradación selectiva se conoce como procesamiento dependiente de ubiquitina/proteasoma regulado (RUP). [71]
Aunque la mayoría de los sustratos proteasómicos deben estar ubiquitinados antes de ser degradados, existen algunas excepciones a esta regla general, especialmente cuando el proteosoma desempeña un papel normal en el procesamiento postraduccional de la proteína. La activación proteasomal de NF-κB mediante el procesamiento de p105 en p50 mediante proteólisis interna es un ejemplo importante. [70] Algunas proteínas que se supone que son inestables debido a regiones intrínsecamente no estructuradas , [72] se degradan de manera independiente de la ubiquitina. El ejemplo más conocido de sustrato de proteasoma independiente de ubiquitina es la enzima ornitina descarboxilasa . [73] También se han informado mecanismos independientes de la ubiquitina que se dirigen a reguladores clave del ciclo celular , como p53 , aunque p53 también está sujeto a degradación dependiente de la ubiquitina. [74] Finalmente, las proteínas estructuralmente anormales, mal plegadas o altamente oxidadas también están sujetas a degradación independiente de ubiquitina y 19S en condiciones de estrés celular. [75]
El proteosoma 20S es ubicuo y esencial en eucariotas y arqueas. El orden bacteriano Actinomycetales también comparte homólogos del proteosoma 20S, mientras que la mayoría de las bacterias poseen genes de choque térmico hslV y hslU , cuyos productos genéticos son una proteasa multimérica dispuesta en un anillo de dos capas y una ATPasa. [76] Se ha planteado la hipótesis de que la proteína hslV se parece al probable ancestro del proteosoma 20S. [77] En general, el HslV no es esencial en las bacterias y no todas las bacterias lo poseen, mientras que algunos protistas poseen tanto el sistema 20S como el hslV. [76] Muchas bacterias también poseen otros homólogos del proteosoma y una ATPasa asociada, sobre todo ClpP y ClpX . Esta redundancia explica por qué el sistema HslUV no es imprescindible.
El análisis de secuencia sugiere que las subunidades β catalíticas divergieron antes en la evolución que las subunidades α predominantemente estructurales. En las bacterias que expresan un proteosoma 20S, las subunidades β tienen una alta identidad de secuencia con las subunidades β de arqueas y eucariotas, mientras que la identidad de secuencia α es mucho menor. La presencia de proteosomas 20S en bacterias puede resultar de la transferencia lateral de genes , mientras que la diversificación de subunidades entre eucariotas se atribuye a múltiples eventos de duplicación de genes . [76]
La progresión del ciclo celular está controlada por la acción ordenada de las quinasas dependientes de ciclinas (CDK), activadas por ciclinas específicas que delimitan las fases del ciclo celular . Las ciclinas mitóticas, que persisten en la célula durante sólo unos minutos, tienen una de las vidas más cortas de todas las proteínas intracelulares. [1] Después de que un complejo CDK-ciclina ha realizado su función, la ciclina asociada es poliubiquitinada y destruida por el proteosoma, lo que proporciona direccionalidad al ciclo celular. En particular, la salida de la mitosis requiere la disociación dependiente del proteosoma del componente regulador ciclina B del complejo del factor promotor de la mitosis . [78] En las células de vertebrados , puede ocurrir un "deslizamiento" a través del punto de control mitótico que conduce a una salida prematura de la fase M a pesar del retraso de esta salida por parte del punto de control del huso . [79]
Los puntos de control anteriores del ciclo celular, como el control posterior al punto de restricción entre la fase G 1 y la fase S , implican de manera similar la degradación proteasomal de la ciclina A , cuya ubiquitinación es promovida por el complejo promotor de la anafase (APC), una ubiquitina ligasa E3 . [80] El APC y el complejo proteico Skp1/Cul1/F-box ( complejo SCF ) son los dos reguladores clave de la degradación de las ciclinas y el control de los puntos de control; el propio SCF está regulado por la APC mediante la ubiquitinación de la proteína adaptadora, Skp2, que previene la actividad del SCF antes de la transición G1-S. [81]
Los componentes individuales de la partícula 19S tienen sus propias funciones reguladoras. La ganquirina , una oncoproteína identificada recientemente , es uno de los subcomponentes 19S que también se une estrechamente a la quinasa CDK4 dependiente de ciclina y desempeña un papel clave en el reconocimiento de p53 ubiquitinado , a través de su afinidad por la ubiquitina ligasa MDM2 . La ganquirina es antiapoptótica y se ha demostrado que se sobreexpresa en algunos tipos de células tumorales , como el carcinoma hepatocelular . [82]
Al igual que los eucariotas, algunas arqueas también utilizan el proteosoma para controlar el ciclo celular, específicamente controlando la división celular mediada por ESCRT -III. [83]
En las plantas , la señalización mediante auxinas , o fitohormonas que ordenan la dirección y el tropismo del crecimiento de las plantas, induce la dirección de una clase de represores de factores de transcripción conocidos como proteínas Aux/IAA para la degradación proteasomal. Estas proteínas están ubiquitinadas por SCFTIR1 o SCF en complejo con el receptor de auxina TIR1. La degradación de las proteínas Aux/IAA desreprime los factores de transcripción en la familia del factor de respuesta a auxina (ARF) e induce la expresión génica dirigida por ARF. [84] Las consecuencias celulares de la activación de ARF dependen del tipo de planta y la etapa de desarrollo, pero están involucradas en la dirección del crecimiento en las raíces y las venas de las hojas. Se cree que la respuesta específica a la desrepresión de ARF está mediada por la especificidad en el emparejamiento de proteínas ARF y Aux/IAA individuales. [85]
Tanto las señales internas como las externas pueden conducir a la inducción de apoptosis o muerte celular programada. La deconstrucción resultante de los componentes celulares se lleva a cabo principalmente mediante proteasas especializadas conocidas como caspasas , pero el proteosoma también desempeña funciones importantes y diversas en el proceso apoptótico. La participación del proteasoma en este proceso está indicada tanto por el aumento de la ubiquitinación de proteínas como de las enzimas E1, E2 y E3 que se observa mucho antes de la apoptosis. [86] [87] [88] Durante la apoptosis, también se ha observado que los proteosomas localizados en el núcleo se trasladan a ampollas de la membrana externa características de la apoptosis. [89]
La inhibición del proteasoma tiene diferentes efectos sobre la inducción de la apoptosis en diferentes tipos de células. En general, el proteosoma no es necesario para la apoptosis, aunque inhibirlo es proapoptótico en la mayoría de los tipos de células que se han estudiado. La apoptosis está mediada por la interrupción de la degradación regulada de las proteínas del ciclo celular que favorecen el crecimiento. [90] Sin embargo, algunas líneas celulares, en particular, cultivos primarios de células inactivas y diferenciadas , como timocitos y neuronas , no pueden sufrir apoptosis al exponerse a inhibidores del proteosoma. El mecanismo de este efecto no está claro, pero se supone que es específico de las células en estados de reposo o que resulta de la actividad diferencial de la quinasa proapoptótica JNK . [91] La capacidad de los inhibidores del proteasoma para inducir apoptosis en células que se dividen rápidamente se ha aprovechado en varios agentes quimioterapéuticos desarrollados recientemente , como bortezomib y salinosporamida A.
En respuesta al estrés celular, como infección , choque térmico o daño oxidativo , se expresan proteínas de choque térmico que identifican proteínas mal plegadas o desplegadas y las atacan para su degradación proteasomal. Tanto Hsp27 como Hsp90 , proteínas chaperonas , han sido implicadas en el aumento de la actividad del sistema ubiquitina-proteosoma, aunque no participan directamente en el proceso. [92] Hsp70 , por otro lado, se une a parches hidrofóbicos expuestos en la superficie de proteínas mal plegadas y recluta ligasas de ubiquitina E3 como CHIP para marcar las proteínas para la degradación proteasomal. [93] La proteína CHIP (extremo carboxilo de la proteína que interactúa con Hsp70) se regula a través de la inhibición de las interacciones entre la enzima E3 CHIP y su pareja de unión E2. [94]
Existen mecanismos similares para promover la degradación de proteínas dañadas por oxidación a través del sistema proteosoma. En particular, los proteosomas localizados en el núcleo están regulados por PARP y degradan activamente las histonas oxidadas de manera inapropiada . [95] Las proteínas oxidadas, que a menudo forman grandes agregados amorfos en la célula, pueden ser degradadas directamente por la partícula central 20S sin la tapa reguladora 19S y no requieren hidrólisis de ATP ni etiquetado con ubiquitina. [75] Sin embargo, los altos niveles de daño oxidativo aumentan el grado de entrecruzamiento entre los fragmentos de proteínas, lo que hace que los agregados sean resistentes a la proteólisis. Un mayor número y tamaño de estos agregados altamente oxidados están asociados con el envejecimiento . [96]
La desregulación del sistema proteosoma de ubiquitina puede contribuir a varias enfermedades neuronales. Puede provocar tumores cerebrales como astrocitomas . [97] En algunas de las enfermedades neurodegenerativas de aparición tardía que comparten la agregación de proteínas mal plegadas como una característica común, como la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer , se pueden formar grandes agregados insolubles de proteínas mal plegadas y luego resultar en neurotoxicidad , a través de mecanismos que no son pero bien entendido. Se ha sugerido que la disminución de la actividad del proteosoma es una causa de agregación y formación de cuerpos de Lewy en el Parkinson. [98] Esta hipótesis está respaldada por la observación de que los modelos de levadura del Parkinson son más susceptibles a la toxicidad de la α-sinucleína , el principal componente proteico de los cuerpos de Lewy, en condiciones de baja actividad del proteasoma. [99] La actividad proteasomal alterada puede ser la causa de trastornos cognitivos como los trastornos del espectro autista y enfermedades de músculos y nervios como la miopatía por cuerpos de inclusión . [97]
El proteosoma desempeña un papel sencillo pero fundamental en la función del sistema inmunológico adaptativo . Los antígenos peptídicos se muestran mediante proteínas del complejo principal de histocompatibilidad de clase I (MHC) en la superficie de las células presentadoras de antígenos . Estos péptidos son productos de la degradación proteasomal de proteínas originadas por el patógeno invasor . Aunque los proteosomas expresados constitutivamente pueden participar en este proceso, un complejo especializado compuesto de proteínas, cuya expresión es inducida por interferón gamma , son los principales productores de péptidos que son óptimos en tamaño y composición para la unión al MHC. Estas proteínas cuya expresión aumenta durante la respuesta inmune incluyen la partícula reguladora 11S, cuyo principal papel biológico conocido es regular la producción de ligandos del MHC, y subunidades β especializadas llamadas β1i, β2i y β5i con especificidad de sustrato alterada. El complejo formado con las subunidades β especializadas se conoce como inmunoproteasoma . [16] Otra subunidad variante de β5i, β5t, se expresa en el timo, lo que da lugar a un " timoproteasoma " específico del timo cuya función aún no está clara. [100]
La fuerza de la unión del ligando del MHC de clase I depende de la composición del extremo C del ligando , ya que los péptidos se unen mediante enlaces de hidrógeno y mediante contactos estrechos con una región llamada "bolsillo B" en la superficie del MHC. Muchos alelos del MHC de clase I prefieren residuos C-terminales hidrófobos, y es más probable que el complejo inmunoproteosoma genere extremos C-terminales hidrófobos. [101]
Debido a su papel en la generación de la forma activada de NF-κB , un regulador antiapoptótico y proinflamatorio de la expresión de citocinas , la actividad proteasomal se ha relacionado con enfermedades inflamatorias y autoinmunes . Los niveles elevados de actividad del proteasoma se correlacionan con la actividad de la enfermedad y se han implicado en enfermedades autoinmunes, incluido el lupus eritematoso sistémico y la artritis reumatoide . [dieciséis]
El proteasoma también participa en la proteólisis intracelular mediada por anticuerpos de viriones unidos a anticuerpos. En esta vía de neutralización, TRIM21 (una proteína de la familia de motivos tripartitos) se une a la inmunoglobulina G para dirigir el virión al proteosoma donde se degrada. [102]
Los inhibidores del proteasoma tienen una actividad antitumoral eficaz en cultivos celulares , induciendo la apoptosis al alterar la degradación regulada de las proteínas del ciclo celular que favorecen el crecimiento. [90] Este enfoque de inducir selectivamente la apoptosis en células tumorales ha demostrado ser eficaz en modelos animales y ensayos en humanos.
La lactacistina , un producto natural sintetizado por la bacteria Streptomyces , fue el primer inhibidor del proteasoma no peptídico descubierto [103] y se utiliza ampliamente como herramienta de investigación en bioquímica y biología celular. Lactacystin obtuvo la licencia de Myogenics/Proscript, que fue adquirida por Millennium Pharmaceuticals , ahora parte de Takeda Pharmaceuticals . La lactacistina modifica covalentemente la treonina amino terminal de las subunidades β catalíticas del proteasoma, particularmente la subunidad β5 responsable de la actividad similar a la quimotripsina del proteasoma. "Este descubrimiento ayudó a establecer el proteosoma como una clase de proteasa mecánicamente nueva: una treonina proteasa amino-terminal ".
Bortezomib (Boronated MG132), una molécula desarrollada por Millennium Pharmaceuticals y comercializada como Velcade, es el primer inhibidor del proteosoma que alcanza uso clínico como agente de quimioterapia . [104] Bortezomib se utiliza en el tratamiento del mieloma múltiple . [105] En particular, se ha observado que el mieloma múltiple produce un aumento de los niveles de péptidos derivados del proteosoma en el suero sanguíneo que disminuyen a niveles normales en respuesta a una quimioterapia exitosa. [106] Los estudios en animales han indicado que bortezomib también puede tener efectos clínicamente significativos en el cáncer de páncreas . [107] [108] Se han iniciado estudios preclínicos y clínicos iniciales para examinar la eficacia de bortezomib en el tratamiento de otros cánceres relacionados con las células B , [109] en particular algunos tipos de linfoma no Hodgkin . [110] Los resultados clínicos también parecen justificar el uso de inhibidores del proteasoma combinados con quimioterapia para la leucemia linfoblástica aguda de células B. [111] Los inhibidores del proteasoma pueden matar algunos tipos de células leucémicas cultivadas que son resistentes a los glucocorticoides. [112]
La molécula ritonavir , comercializada como Norvir, fue desarrollada como inhibidor de la proteasa y utilizada para combatir la infección por VIH . Sin embargo, se ha demostrado que inhibe los proteosomas así como las proteasas libres; Para ser específicos, la actividad similar a la quimotripsina del proteosoma es inhibida por ritonavir, mientras que la actividad similar a la tripsina aumenta algo. [113] Los estudios en modelos animales sugieren que ritonavir puede tener efectos inhibidores sobre el crecimiento de las células de glioma . [114]
Los inhibidores del proteasoma también se han mostrado prometedores en el tratamiento de enfermedades autoinmunes en modelos animales. Por ejemplo, estudios en ratones portadores de injertos de piel humana encontraron una reducción en el tamaño de las lesiones de psoriasis después del tratamiento con un inhibidor del proteasoma. [115] Los inhibidores también muestran efectos positivos en modelos de asma en roedores . [116]
El etiquetado y la inhibición del proteasoma también son de interés en entornos de laboratorio para el estudio tanto in vitro como in vivo de la actividad proteasómica en las células. Los inhibidores de laboratorio más utilizados son la lactacistina y el péptido aldehído MG132 desarrollado inicialmente por el laboratorio Goldberg. También se han desarrollado inhibidores fluorescentes para marcar específicamente los sitios activos del proteasoma ensamblado. [117]
El proteasoma y sus subunidades tienen importancia clínica por al menos dos razones: (1) un ensamblaje complejo comprometido o un proteasoma disfuncional pueden asociarse con la fisiopatología subyacente de enfermedades específicas, y (2) pueden explotarse como objetivos farmacológicos con fines terapéuticos. intervenciones. Más recientemente, se han hecho más esfuerzos para considerar el proteasoma para el desarrollo de nuevos marcadores y estrategias de diagnóstico. Una comprensión mejorada y completa de la fisiopatología del proteosoma debería conducir a aplicaciones clínicas en el futuro.
Los proteosomas forman un componente fundamental para el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) [118] y el correspondiente control de calidad de proteínas celulares (PQC). La ubiquitinación de proteínas y la posterior proteólisis y degradación por parte del proteosoma son mecanismos importantes en la regulación del ciclo celular , el crecimiento y diferenciación celular , la transcripción de genes, la transducción de señales y la apoptosis . [119] Los defectos del proteasoma conducen a una actividad proteolítica reducida y a la acumulación de proteínas dañadas o mal plegadas, lo que puede contribuir a enfermedades neurodegenerativas, [120] [121] enfermedades cardiovasculares, [122] [123] [124] respuestas inflamatorias y enfermedades autoinmunes. [125] y respuestas sistémicas al daño del ADN que conducen a tumores malignos . [126]
Las investigaciones han implicado defectos del UPS en la patogénesis de trastornos neurodegenerativos y miodegenerativos, incluida la enfermedad de Alzheimer , [127] la enfermedad de Parkinson [128] y la enfermedad de Pick , [129] la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), [129] la enfermedad de Huntington , [128] Creutzfeldt –Enfermedad de Jakob , [130] y enfermedades de las neuronas motoras, enfermedades por poliglutamina (PolyQ), distrofias musculares [131] y varias formas raras de enfermedades neurodegenerativas asociadas con la demencia . [132] Como parte del sistema ubiquitina-proteasoma (UPS), el proteasoma mantiene la homeostasis de las proteínas cardíacas y, por lo tanto, desempeña un papel importante en la lesión isquémica cardíaca , [133] la hipertrofia ventricular [134] y la insuficiencia cardíaca . [135] Además, se están acumulando pruebas de que el UPS desempeña un papel esencial en la transformación maligna. La proteólisis UPS juega un papel importante en las respuestas de las células cancerosas a señales estimulantes que son críticas para el desarrollo del cáncer. En consecuencia, la expresión génica mediante la degradación de factores de transcripción , como p53 , c-jun , c-Fos , NF-κB , c-Myc , HIF-1α, MATα2, STAT3 , proteínas de unión a elementos reguladas por esteroles y receptores de andrógenos son todos controlados por la UPS y, por lo tanto, involucrados en el desarrollo de diversas neoplasias malignas. [136] Además, el UPS regula la degradación de productos de genes supresores de tumores, como la poliposis coli adenomatosa (APC) en el cáncer colorrectal y el retinoblastoma (Rb). y el supresor de tumores de von Hippel-Lindau (VHL), así como varios protooncogenes ( Raf , Myc , Myb , Rel , Src , Mos , ABL ). El UPS también participa en la regulación de las respuestas inflamatorias. Esta actividad generalmente se atribuye al papel de los proteosomas en la activación de NF-κB, que regula aún más la expresión de citocinas proinflamatorias como TNF-α , IL-β, IL-8 , moléculas de adhesión ( ICAM-1 , VCAM-1 , P-selectina ) yprostaglandinas y óxido nítrico (NO). [125] Además, el UPS también desempeña un papel en las respuestas inflamatorias como reguladores de la proliferación de leucocitos, principalmente a través de la proteólisis de ciclinas y la degradación de inhibidores de CDK . [137] Por último, los pacientes con enfermedades autoinmunes como LES , síndrome de Sjögren y artritis reumatoide (AR) exhiben predominantemente proteosomas circulantes que pueden aplicarse como biomarcadores clínicos. [138]
