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Bioconjugación

Anticuerpo monoclonal ibritumomab conjugado con tiuxetan

La bioconjugación es una estrategia química para formar un enlace covalente estable entre dos moléculas, al menos una de las cuales es una biomolécula . Los métodos para conjugar biomoléculas se aplican en varios campos, incluidos la medicina, el diagnóstico, la biocatálisis y los materiales. Las biomoléculas modificadas sintéticamente pueden tener diversas funcionalidades, como rastrear eventos celulares, revelar la función enzimática , determinar la biodistribución de proteínas , obtener imágenes de biomarcadores específicos y administrar medicamentos a células específicas. [1] [2] [3] [4]

La bioconjugación es una estrategia crucial que vincula estas biomoléculas modificadas con diferentes sustratos . Además de las aplicaciones en la investigación biomédica, la bioconjugación también ha ganado importancia recientemente en la nanotecnología, como los puntos cuánticos bioconjugados .

Los tipos más comunes de bioconjugación incluyen el acoplamiento de una molécula pequeña (como la biotina o un colorante fluorescente) a una proteína. Los conjugados anticuerpo-fármaco como Brentuximab vedotin y Gemtuzumab ozogamicina son ejemplos que entran en esta categoría. [5] Otras moléculas menos comunes utilizadas en la bioconjugación son oligosacáridos , ácidos nucleicos , polímeros sintéticos como polietilenglicol , [6] y nanotubos de carbono . [7] Las conjugaciones proteína-proteína, como el acoplamiento de un anticuerpo a una enzima, o la unión de complejos proteicos, también se facilitan a través de bioconjugaciones. [8] [9]

Reacciones de bioconjugación comunes

La síntesis de bioconjugados implica una variedad de desafíos, que van desde el uso simple e inespecífico de un marcador de tinte fluorescente hasta el diseño complejo de conjugados de anticuerpos y fármacos . [1] [3] Se han desarrollado varias reacciones de bioconjugación para modificar químicamente las proteínas. Los tipos comunes de reacciones de bioconjugación en proteínas son el acoplamiento de residuos de aminoácidos lisina , cisteína y tirosina , así como la modificación de residuos de triptófano y de los extremos N y C. [1] [3] [4]

Sin embargo, estas reacciones a menudo carecen de quimioselectividad y eficiencia, porque dependen de la presencia de aminoácidos nativos, que están presentes en grandes cantidades que dificultan la selectividad. Existe una creciente necesidad de estrategias químicas que puedan unir eficazmente las moléculas sintéticas en un sitio específico a las proteínas. Una estrategia es instalar primero un grupo funcional único en una proteína, y luego se utiliza una reacción bioortogonal para acoplar una biomolécula con este grupo funcional único. [1] Las reacciones bioortogonales dirigidas a grupos funcionales no nativos se utilizan ampliamente en la química de bioconjugación. Algunas reacciones importantes son la modificación de cetonas y aldehídos , la ligadura de Staudinger con azidas orgánicas , la cicloadición de azidas de Huisgen catalizada por cobre y la cicloadición de azidas de Huisgen promovida por cepas. [10] [11] [12] [13]

Sobre los aminoácidos naturales

Reacciones de las lisinas

El residuo de lisina nucleofílica es un sitio comúnmente objetivo en la bioconjugación de proteínas, típicamente a través de ésteres de N -hidroxisuccinimidilo (NHS) reactivos con amina . [3] Para obtener un número óptimo de residuos de lisina desprotonados , el pH de la solución acuosa debe estar por debajo del pKa del grupo amonio de la lisina , que es alrededor de 10,5, por lo que el pH típico de la reacción es de aproximadamente 8 y 9. El reactivo común para la reacción de acoplamiento es el éster de NHS (mostrado en la primera reacción a continuación en la Figura 1 ), que reacciona con la lisina nucleofílica a través de un mecanismo de acilación de lisina . Otros reactivos similares son los isocianatos e isotiocianatos que experimentan un mecanismo similar (mostrados en la segunda y tercera reacciones en la Figura 1 a continuación). [1] Los fluoruros de benzoilo (mostrados en la última reacción a continuación en la Figura 1 ), que permiten la modificación de proteínas con lisina en condiciones suaves (baja temperatura, pH fisiológico ), se propusieron recientemente como una alternativa a los reactivos específicos de lisina utilizados clásicamente. [14]

Figura 1. Estrategias de bioconjugación para residuos de lisina.png

Reacciones de las cisteínas

Debido a que la cisteína libre rara vez se presenta en la superficie de la proteína, es una excelente opción para la modificación quimioselectiva. [15] Bajo condiciones básicas, los residuos de cisteína se desprotonarán para generar un nucleófilo tiolato , que reaccionará con electrófilos blandos , como maleimidas y yodoacetamidas (mostrados en las primeras dos reacciones en la Figura 2 a continuación). Como resultado, se forma un enlace carbono-azufre . Otra modificación de los residuos de cisteína implica la formación de un enlace disulfuro (mostrado en la tercera reacción en la Figura 2 ). Los residuos de cisteína reducidos reaccionan con disulfuros exógenos , generando un nuevo enlace disulfuro en la proteína. A menudo se utiliza un exceso de disulfuros para impulsar la reacción, como 2-tiopiridona y 3-carboxi-4-nitrotiofenol. [1] [3] Se demostró que los alquinos deficientes en electrones reaccionan selectivamente con residuos de cisteína de proteínas en presencia de otros residuos de aminoácidos nucleofílicos. Dependiendo de la sustitución del alquino, estas reacciones pueden producir bioconjugados escindibles (cuando se utilizan derivados de alquinona) [16] o hidrolíticamente estables (cuando se utilizan 3-arilpropiolonitrilos ; la última reacción a continuación en la Figura 2 ). [17]

Figura 2. Estrategias de bioconjugación para residuos de cisteína.jpg

Reacciones de las tirosinas

Los residuos de tirosina son relativamente poco reactivos; por lo tanto, no han sido un objetivo popular para la bioconjugación. El desarrollo reciente ha demostrado que la tirosina se puede modificar a través de reacciones de sustituciones aromáticas electrofílicas (EAS), y es selectiva para el carbono aromático adyacente al grupo hidroxilo fenólico . [1] Esto se vuelve particularmente útil en el caso de que los residuos de cisteína no puedan ser el objetivo. Específicamente, el diazonio se acopla efectivamente con residuos de tirosina ( la sal de diazonio se muestra como reactivo en la primera reacción en la Figura 3 a continuación), y un sustituyente atractor de electrones en la posición 4 de la sal de diazonio puede aumentar efectivamente la eficiencia de la reacción. Se informó que el derivado de diazodicarboxiamida cíclica como 4-fenil-1,2,4-triazol-3,5-diona (PTAD) es selectivo para la bioconjugación en residuos de tirosina (la segunda reacción en la Figura 3 a continuación). [18] También se describió que una reacción de tipo Mannich de tres componentes con aldehídos y anilinas (la última reacción en la Figura 3 ) era relativamente selectiva para la tirosina en condiciones de reacción optimizadas suaves. [19]

Figura 3. Estrategias de bioconjugación para residuos de tirosina.

Reacciones de los extremos N y C

Dado que los residuos de aminoácidos naturales suelen estar presentes en grandes cantidades, a menudo es difícil modificar un solo sitio. Se han desarrollado estrategias dirigidas a los extremos de la proteína, porque mejoran en gran medida la selectividad del sitio de modificación de la proteína. Una de las modificaciones de los extremos N implica la funcionalización del aminoácido terminal. La oxidación de los residuos de serina y treonina N-terminales puede generar aldehído N-terminal, que puede sufrir reacciones bioortogonales adicionales (mostradas en la primera reacción en la Figura 4 ). Otro tipo de modificación implica la condensación de la cisteína N-terminal con aldehído, generando tiazolidina que es estable a pH alto (segunda reacción en la Figura 4 ). Usando fosfato de piridoxal (PLP), varios aminoácidos N-terminales pueden sufrir transaminación para producir aldehído N-terminal , como glicina y ácido aspártico (tercera reacción en la Figura 4 ).

Figura 4. Estrategias de bioconjugación para el extremo N.jpg

Un ejemplo de modificación del extremo C es la ligadura química nativa (NCL), que es el acoplamiento entre un tioéster C-terminal y una cisteína N-terminal ( Figura 5 ).

Figura 5. Estrategias de bioconjugación para el extremo C.jpg

Reacciones bioortogonales: sobre grupos funcionales únicos

Modificación de cetonas y aldehídos.

Una cetona o un aldehído se pueden unir a una proteína a través de la oxidación de los residuos de serina N-terminales o la transaminación con PLP. Además, se pueden introducir incorporando aminoácidos no naturales a través del método de Tirrell o el método de Schultz. [10] Luego se condensarán selectivamente con una alcoxiamina y una hidrazina , produciendo derivados de oxima e hidrazona (mostrados en la primera y segunda reacciones, respectivamente, en la Figura 6 ). Esta reacción es altamente quimioselectiva en términos de bioconjugación de proteínas, pero la velocidad de reacción es lenta. Los estudios mecanísticos muestran que el paso determinante de la velocidad es la deshidratación del intermedio tetraédrico , por lo que a menudo se emplea una solución ácida suave para acelerar el paso de deshidratación. [2]

Figura 6. Estrategias de bioconjugación para la focalización de cetonas y aldehídos.jpg

La introducción de un catalizador nucleofílico puede mejorar significativamente la velocidad de reacción (mostrado en la Figura 7 ). Por ejemplo, utilizando anilina como catalizador nucleofílico, un carbonilo protonado menos poblado se convierte en una base de Schiff protonada altamente poblada . [20] En otras palabras, genera una alta concentración de electrófilo reactivo. La ligación de oxima puede entonces ocurrir fácilmente, y se ha informado que la velocidad aumentó hasta 400 veces en condiciones de acidez suave. [20] La clave de este catalizador es que puede generar un electrófilo reactivo sin competir con el producto deseado.

Figura 7. Catálisis nucleofílica de la ligación de oximas.jpg

Los desarrollos recientes que explotan los grupos funcionales proximales han permitido que las condensaciones de hidrazona [21] funcionen a 20 M −1 s −1 a pH neutro, mientras que se han descubierto condensaciones de oxima que se producen a 500-10000 M −1 s −1 a pH neutro sin catalizadores añadidos. [22] [23]

Ligadura de Staudinger con azidas

La ligación de Staudinger de azidas y fosfina se ha utilizado ampliamente en el campo de la biología química. Debido a que es capaz de formar un enlace amida estable en células vivas y animales, se ha aplicado a la modificación de la membrana celular , la obtención de imágenes in vivo y otros estudios de bioconjugación. [24] [25] [26] [27]


Figura 8. Ligadura de Staudinger con Azidas.jpg

En contraste con la reacción clásica de Staudinger, la ligación de Staudinger es una reacción de segundo orden en la que el paso limitante de la velocidad es la formación de fosfazida (mecanismo de reacción específico mostrado en la Figura 9 ). La trifenilfosfina primero reacciona con la azida para producir una azailida a través de un estado de transición de anillo de cuatro miembros , y luego una reacción intramolecular conduce al intermedio iminofosforano , que luego dará el enlace amida bajo hidrólisis. [28]

Figura 9. Mecanismo de ligadura de Staudinger.jpg

Ciclación de azidas de Huisgen

Ciclización de azidas por Huisgen catalizada por cobre

La azida se ha convertido en un objetivo popular para la modificación quimioselectiva de proteínas, debido a que son pequeñas en tamaño y tienen un potencial de reacción termodinámica favorable . Una de estas reacciones de azida es la reacción de cicloadición [3+2] con alquino , pero la reacción requiere alta temperatura y a menudo da lugar a mezclas de regioisómeros .

Figura 10. Ciclación de azidas catalizada por cobre.jpg

Una reacción mejorada desarrollada por el químico Karl Barry Sharpless involucra el catalizador de cobre (I), que acopla la azida con el alquino terminal que solo da 1,2,3 triazoles 1,4 sustituidos en altos rendimientos (mostrados a continuación en la Figura 11 ). El estudio mecanicista sugiere una reacción escalonada. [13] El Cu (I) primero se acopla con acetilenos y luego reacciona con la azida para generar un intermedio de seis miembros. El proceso es muy robusto y ocurre a un pH que varía de 4 a 12, y el sulfato de cobre (II) se usa a menudo como catalizador en presencia de un agente reductor . [13]

Figura 11. Mecanismo de ciclización de azidas catalizada por cobre.jpg

La cepa promovió la ciclización de azidas por Huisgen

Aunque la ligación de Staudinger es una bioconjugación adecuada en células vivas sin toxicidad importante, la sensibilidad de la fosfina a la oxidación del aire y su baja solubilidad en agua obstaculizan significativamente su eficiencia. El acoplamiento azida-alquino catalizado por cobre (I) tiene una velocidad de reacción y una eficiencia razonables en condiciones fisiológicas, pero el cobre plantea una toxicidad significativa y, a veces, interfiere con las funciones de las proteínas en las células vivas. En 2004, el laboratorio de la química Carolyn R. Bertozzi desarrolló una cicloadición [3+2] libre de metales utilizando ciclooctina y azida tensadas . La ciclooctina, que es el cicloalquino estable más pequeño, puede acoplarse con la azida a través de la cicloadición [3+2], lo que da lugar a dos triazoles regioisoméricos ( Figura 12 ). [11] La reacción ocurre fácilmente a temperatura ambiente y, por lo tanto, se puede utilizar para modificar eficazmente las células vivas sin efectos negativos. También se ha informado de que la instalación de sustituyentes de flúor en un alquino cíclico puede acelerar en gran medida la velocidad de reacción. [2] [29]

Figura 12. Cicloadición de azidas y ciclooctinas promovida por la deformación.jpg

Reacciones de bioconjugación mediadas por metales de transición

La bioconjugación basada en metales de transición ha sido un desafío debido a la naturaleza de las condiciones biológicas (solución acuosa, temperatura ambiente, pH moderado y bajas concentraciones de sustrato), que generalmente son desafiantes para las reacciones organometálicas . Sin embargo, recientemente, además de la reacción de cicloadición de azida alquina catalizada por cobre [3 + 2] , se han aplicado cada vez más transformaciones químicas mediadas por metales de transición para reacciones de bioconjugación, introduciendo metátesis de olefinas , alquilación, arilación C–H, reacciones de acoplamiento cruzado C–C, C–S y C–N . [30] [31]

Alquilación

Sobre los aminoácidos naturales

Utilizando Rh II -carbenoide generado in situ mediante la activación de compuestos diazo sustituidos con vinilo con Rh 2 (OAc) 4 , se demostró que los triptófanos y las cisteínas se alquilan selectivamente en medios acuosos.

Sin embargo, este método está limitado a los triptófanos y cisteínas de superficie, posiblemente debido a restricciones estéricas. [34]

Las iminas formadas a partir de la condensación de aldehídos con lisinas o el extremo N pueden reducirse de manera eficiente mediante un complejo [Cp*Ir(bipy)(H 2 O)]SO 4 estable en agua en presencia de iones formiato (que sirven como fuente de hidruro). La reacción ocurre fácilmente en condiciones fisiológicamente relevantes y da como resultado una alta conversión para varios aldehídos aromáticos.

Mediante el uso de un reactivo de π-alilpaladio(II) electrófilo preformado derivado de precursores de acetato alílico o carbamato, se puede lograr la alquilación alílica selectiva de tirosinas en solución acuosa a temperatura ambiente y en presencia de cisteínas.

Se ha demostrado que los péptidos que contienen cisteína experimentan una adición 1,2 a alenos en presencia de sales de oro(I) y/o plata(I), lo que produce tioéteres de vinilo sustituidos con hidroxilo. La reacción con péptidos se produce con altos rendimientos y es selectiva para las cisteínas frente a otros residuos nucleofílicos.

Sin embargo, la reactividad hacia las proteínas está muy disminuida, posiblemente debido a la coordinación del oro con la cadena principal de la proteína.

Arilación

Sobre los aminoácidos naturales

Se han informado múltiples métodos para lograr la arilación C–H del triptófano, donde se han utilizado diversos electrófilos como haluros de arilo [38] [39] y ácidos aril borónicos [40] (un ejemplo que se muestra a continuación) para transferir los grupos arilo.

Sin embargo, las condiciones actuales de la reacción de arilación de triptófano C–H siguen siendo relativamente duras y requieren disolventes orgánicos, pH bajo y/o temperaturas altas.

Se ha considerado que los tioles libres son desfavorables para las reacciones mediadas por Pd debido a la descomposición del catalizador de Pd. [41] Sin embargo, los complejos de adición oxidativa (OAC) de Pd II soportados por ligandos de fosfina de dialquilbiaril han demostrado funcionar de manera eficiente hacia la S-arilación de cisteína.

El primer ejemplo es el uso de Pd II OAC con RuPhos : [42] El complejo Pd II resultante de la adición oxidativa de haluros de arilo o trifluorometanosulfonatos y utilizando RuPhos como ligando podría modificar quimioselectivamente las cisteínas en varios tampones con un 5% de cosolvente orgánico bajo pH neutro. Se ha demostrado que este método modifica péptidos y proteínas, logra la macrociclización de péptidos (mediante el uso de reactivo de bis-paladio y péptidos con dos cisteínas desprotegidas) [43] y sintetiza conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) . Cambiar el ligando a sSPhos ayuda al complejo Pd II a ser suficientemente soluble en agua para lograr la S-arilación de cisteína en condiciones acuosas sin cosolvente. [44]

Existen otras aplicaciones de este método en las que los complejos Pd II se generaron como OAC Pd II -péptido introduciendo 4-halofenilalanina en péptidos durante SPPS para lograr la ligadura péptido-péptido o péptido-proteína. [45]

Como alternativa a la adición oxidativa directa al péptido, los OAC de Pd también podrían transferirse a la proteína mediante una reacción de acilación selectiva de aminas mediante un éster NHS. Esto último se ha aplicado para marcar selectivamente los residuos de lisina de la superficie de una proteína (formando OAC de proteína Pd II ) y oligonucleótidos (formando OAC de oligonucleótido Pd II ), que luego podrían unirse a péptidos o proteínas que contienen cisteína. [46]

Otro ejemplo de acoplamiento cruzado proteína-proteína se logra mediante la conversión de residuos de cisteína en un OAC S-aril-Pd-X electrofílico utilizando una estrategia de adición oxidativa intramolecular. [47]

De manera similar a la cisteína, la N-arilación de la lisina se puede lograr a través de OAC de Pd con diferentes ligandos de fosfina de dialquilbiaril . Debido a la nucleofilicidad más débil y la tasa de eliminación reductora más lenta en comparación con la cisteína, se ha demostrado que la selección de ligandos de soporte es crítica. Los voluminosos ligandos BrettPhos y t -BuBrettPhos junto con fenóxido de sodio ligeramente básico se han utilizado como estrategia para funcionalizar lisinas en sustratos peptídicos. La reacción ocurre en condiciones suaves y es selectiva sobre la mayoría de los demás residuos de aminoácidos nucleofílicos.

Sobre los aminoácidos no naturales

Las reacciones de acoplamiento cruzado de Sonogashira , Heck y Suzuki-Miyaura mediadas por Pd se han aplicado ampliamente para modificar péptidos y proteínas, donde se han desarrollado diversos reactivos de Pd para la aplicación en soluciones acuosas. [49] Esas reacciones requieren que el sustrato proteico o peptídico contenga grupos funcionales no naturales como alquino, [50] [51] [52] haluros de arilo, [53] [54] [55] [56] y ácidos arilborónicos, [57] que se pueden lograr a través de la expansión del código genético o modificaciones postraduccionales.

Ejemplos de técnicas de bioconjugación aplicadas

Factores de crecimiento

Se ha informado sobre la bioconjugación de TGF-β con nanopartículas de óxido de hierro y su activación a través de hipertermia magnética in vitro. [58] Esto se realizó utilizando 1-(3-dimetilaminopropil)etilcarbodiimida combinada con N-hidroxisuccinimida para formar enlaces amida primarios con las aminas primarias libres en el factor de crecimiento. Los nanotubos de carbono se han utilizado con éxito junto con la bioconjugación para unir TGF-β seguido de una activación con luz infrarroja cercana. [59] Por lo general, estas reacciones han implicado el uso de un agente de reticulación, pero algunos de estos agregan espacio molecular entre el compuesto de interés y el material base y, a su vez, causan mayores grados de unión no específica y reactividad no deseada. [60]

Véase también

Referencias

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