La ciclización in situ de proteínas ( INCYPRO ) es una tecnología de ingeniería de proteínas que aumenta la durabilidad de las proteínas y enzimas para aplicaciones biotecnológicas y biomédicas. [1] [2] Para tales aplicaciones, es esencial que las proteínas utilizadas mantengan su integridad estructural. [3] Sin embargo, esto a menudo es un desafío debido a las condiciones requeridas para estas aplicaciones que requieren ingeniería de proteínas para estabilizar la estructura de la proteína. [4] La tecnología INCYPRO implica la unión de ligaduras moleculares (enlaces cruzados) a una proteína, reduciendo así la tendencia de la proteína a desplegarse. Las proteínas reticuladas con INCYPRO resultantes son más estables a temperatura elevada y en presencia de desnaturalizantes químicos. [5]
La tecnología INCYPRO utiliza moléculas tris-reactivas para reticular tres posiciones definidas dentro de una proteína [1] o complejo proteico. [6] Por ejemplo, INCYPRO puede implicar la introducción de tres cisteínas alineadas espacialmente y accesibles al solvente en la proteína que luego se hacen reaccionar con un agente tris-electrófilo. Se ha demostrado que las proteínas o complejos proteicos reticulados resultantes exhiben una mayor estabilidad frente al estrés térmico y químico y una menor tendencia a la agregación. [1] [6] Hasta ahora, la temperatura de fusión de las proteínas se aumentó hasta 39 °C en un solo paso de diseño. [6]
Un ejemplo temprano, involucró la estabilización de la transpeptidasa Sortase A que resultó en variantes estabilizadas por INCYPRO con actividad a temperatura elevada y en presencia de cloruro de guanidinio . [1] [5] INCYPRO también se ha aplicado para estabilizar el dominio KIX del adaptador humano utilizando diferentes moléculas reticulantes. Aquí, se observó una dependencia de la estabilidad de la proteína en la hidrofilicidad del enlace cruzado. [2] Además, se estabilizó una serie de complejos proteicos homotriméricos, incluida la esterasa de Pseudomonas fluorescens (PFE) y una Enoyl-CoA hidratasa . [6] En estos casos, se generaron conjugados enzimáticos con topología bicíclica general.