La Real Audiencia de Lima fue creada el 20 de noviembre de 1542 junto con el Virreinato del Perú, por el emperador Carlos I y establecida en 1543 extinguiendo e incorporando parte del territorio de la Real Audiencia de Panamá.
En 1566 se le segregaron los territorios de la gobernación del Río de la Plata y del Paraguay, agregándolos a Charcas.
La ciudad del Cuzco y sus dependencias fue reintegrada a la jurisdicción de la Audiencia de Lima, estableciéndose que Charcas conservara el territorio "desde el Collao hacia la Ciudad de La Plata".
Por la orden del 27 de mayo de 1717 que creó el Virreinato de Nueva Granada se mandó suprimir nuevamente la Real Audiencia de Panamá e incorporarla a Lima:
En 1821, debido a que el general José de San Martín se apoderó de Lima, la intendencia de Arequipa fue agregada a la jurisdicción de la Real Audiencia del Cuzco, permaneciendo hasta el final del virreinato en 1825.