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Reacción en cadena de la polimerasa

Una tira de ocho tubos de PCR, cada uno con 100 μL de mezcla de reacción
Colocación de una tira de ocho tubos de PCR en un ciclador térmico

La reacción en cadena de la polimerasa ( PCR ) es un método ampliamente utilizado para realizar de millones a miles de millones de copias de una muestra específica de ADN rápidamente, lo que permite a los científicos amplificar una muestra muy pequeña de ADN (o una parte de ella) lo suficiente como para permitir un estudio detallado. La PCR fue inventada en 1983 por el bioquímico estadounidense Kary Mullis en Cetus Corporation . Mullis y el bioquímico Michael Smith , que habían desarrollado otras formas esenciales de manipular el ADN, recibieron conjuntamente el Premio Nobel de Química en 1993. [1]

La PCR es fundamental para muchos de los procedimientos utilizados en las pruebas e investigaciones genéticas , incluido el análisis de muestras antiguas de ADN y la identificación de agentes infecciosos. Mediante la PCR, se amplifican exponencialmente copias de cantidades muy pequeñas de secuencias de ADN en una serie de ciclos de cambios de temperatura. La PCR es ahora una técnica común y a menudo indispensable que se utiliza en la investigación de laboratorio médico para una amplia variedad de aplicaciones, incluida la investigación biomédica y la ciencia forense . [2] [3]

La mayoría de los métodos de PCR se basan en ciclos térmicos . Los ciclos térmicos exponen los reactivos a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento para permitir diferentes reacciones dependientes de la temperatura, específicamente, la fusión del ADN y la replicación del ADN impulsada por enzimas . La PCR emplea dos reactivos principales: cebadores (que son fragmentos cortos de ADN de una sola hebra conocidos como oligonucleótidos que son una secuencia complementaria a la región de ADN objetivo) y una ADN polimerasa termoestable . En el primer paso de la PCR, las dos hebras de la doble hélice de ADN se separan físicamente a una temperatura alta en un proceso llamado desnaturalización de ácidos nucleicos . En el segundo paso, se reduce la temperatura y los cebadores se unen a las secuencias complementarias de ADN. Las dos hebras de ADN luego se convierten en plantillas para que la ADN polimerasa ensamble enzimáticamente una nueva hebra de ADN a partir de nucleótidos libres , los componentes básicos del ADN. A medida que avanza la PCR, el ADN generado se utiliza como plantilla para la replicación, lo que pone en marcha una reacción en cadena en la que la plantilla de ADN original se amplifica exponencialmente .

Casi todas las aplicaciones de PCR emplean una ADN polimerasa termoestable , como la Taq polimerasa , una enzima aislada originalmente de la bacteria termófila Thermus aquaticus . Si la polimerasa utilizada fuera termoestable, se desnaturalizaría bajo las altas temperaturas del paso de desnaturalización. Antes del uso de la Taq polimerasa, la ADN polimerasa debía agregarse manualmente en cada ciclo, lo que era un proceso tedioso y costoso. [4]

Las aplicaciones de la técnica incluyen la clonación de ADN para secuenciación , clonación y manipulación de genes, mutagénesis genética; construcción de filogenias basadas en ADN o análisis funcional de genes ; diagnóstico y seguimiento de trastornos genéticos ; amplificación de ADN antiguo; [5] análisis de huellas genéticas para perfiles de ADN (por ejemplo, en ciencia forense y pruebas de paternidad ); y detección de patógenos en pruebas de ácido nucleico para el diagnóstico de enfermedades infecciosas .

Principios

Un termociclador más antiguo de tres temperaturas para PCR

La PCR amplifica una región específica de una cadena de ADN (el ADN diana). La mayoría de los métodos de PCR amplifican fragmentos de ADN de entre 0,1 y 10 kilopares de bases (kbp) de longitud, aunque algunas técnicas permiten la amplificación de fragmentos de hasta 40 kbp. [6] La cantidad de producto amplificado está determinada por los sustratos disponibles en la reacción, que se vuelven limitantes a medida que avanza la reacción. [7]

Una configuración básica de PCR requiere varios componentes y reactivos, [8] incluidos:

La reacción se lleva a cabo comúnmente en un volumen de 10 a 200  μL en tubos de reacción pequeños (volúmenes de 0,2 a 0,5 mL) en un termociclador . El termociclador calienta y enfría los tubos de reacción para alcanzar las temperaturas requeridas en cada paso de la reacción (ver a continuación). Muchos termocicladores modernos utilizan un dispositivo Peltier , que permite tanto calentar como enfriar el bloque que contiene los tubos de PCR simplemente invirtiendo la corriente eléctrica del dispositivo. Los tubos de reacción de paredes delgadas permiten una conductividad térmica favorable para permitir un rápido equilibrio térmico. La mayoría de los termocicladores tienen tapas calefactadas para evitar la condensación en la parte superior del tubo de reacción. Los termocicladores más antiguos que carecen de una tapa calefactada requieren una capa de aceite sobre la mezcla de reacción o una bola de cera dentro del tubo. [ cita requerida ]

Procedimiento

Por lo general, la PCR consiste en una serie de 20 a 40 cambios repetidos de temperatura, llamados ciclos térmicos, y cada ciclo suele constar de dos o tres pasos de temperatura discretos (véase la figura siguiente). El ciclo suele ir precedido de un único paso de temperatura a una temperatura muy alta (>90 °C (194 °F)), seguido de una retención al final para la extensión del producto final o un breve almacenamiento. Las temperaturas utilizadas y el tiempo durante el que se aplican en cada ciclo dependen de una variedad de parámetros, incluida la enzima utilizada para la síntesis de ADN, la concentración de iones bivalentes y dNTP en la reacción y la temperatura de fusión ( T m ) de los cebadores. [12] Los pasos individuales comunes a la mayoría de los métodos de PCR son los siguientes:

Es fundamental determinar una temperatura adecuada para el paso de hibridación, ya que la eficiencia y la especificidad se ven fuertemente afectadas por la temperatura de hibridación. Esta temperatura debe ser lo suficientemente baja para permitir la hibridación del cebador con la hebra, pero lo suficientemente alta para que la hibridación sea específica, es decir, el cebador debe unirse solo a una parte perfectamente complementaria de la hebra y a ninguna otra. Si la temperatura es demasiado baja, el cebador puede unirse de manera imperfecta. Si es demasiado alta, el cebador puede no unirse en absoluto. Una temperatura de hibridación típica es de aproximadamente 3 a 5 °C por debajo de la Tm de los cebadores utilizados. Los enlaces de hidrógeno estables entre bases complementarias se forman solo cuando la secuencia del cebador coincide muy de cerca con la secuencia de la plantilla . Durante este paso, la polimerasa se une al híbrido cebador-plantilla y comienza la formación de ADN. [ cita requerida ]
Los procesos de desnaturalización, hibridación y elongación constituyen un único ciclo. Se requieren múltiples ciclos para amplificar el ADN diana a millones de copias. La fórmula utilizada para calcular el número de copias de ADN formadas después de un número determinado de ciclos es 2 n , donde n es el número de ciclos. Por lo tanto, una reacción programada para 30 ciclos da como resultado 2 30 , o 1.073.741.824 copias de la región diana del ADN bicatenario original.
Dibujo esquemático de un ciclo completo de PCR
Dibujo esquemático de un ciclo completo de PCR
Productos de PCR teñidos con bromuro de etidio después de la electroforesis en gel . Se utilizaron dos conjuntos de cebadores para amplificar una secuencia diana de tres muestras de tejido diferentes. No se observa amplificación en la muestra n.° 1; las bandas de ADN en las muestras n.° 2 y n.° 3 indican una amplificación exitosa de la secuencia diana. El gel también muestra un control positivo y una escalera de ADN que contiene fragmentos de ADN de longitud definida para medir el tamaño de las bandas en las PCR experimentales.

Para comprobar si la PCR generó con éxito la región de ADN objetivo prevista (también denominada a veces amplicón o amplímero ), se puede emplear la electroforesis en gel de agarosa para la separación por tamaño de los productos de PCR. El tamaño de los productos de PCR se determina mediante la comparación con una escalera de ADN , un marcador de peso molecular que contiene fragmentos de ADN de tamaños conocidos, que se ejecuta en el gel junto con los productos de PCR.

PCR de Tucker

Etapas

Amplificación exponencial

Al igual que con otras reacciones químicas, la velocidad de reacción y la eficiencia de la PCR se ven afectadas por factores limitantes. Por lo tanto, todo el proceso de PCR se puede dividir en tres etapas según el progreso de la reacción:

Mejoramiento

En la práctica, la PCR puede fallar por diversas razones, como la sensibilidad o la contaminación. [17] [18] La contaminación con ADN extraño puede dar lugar a productos espurios y se aborda con protocolos y procedimientos de laboratorio que separan las mezclas previas a la PCR de los posibles contaminantes del ADN. [8] Por ejemplo, si se analiza el ADN de la escena de un crimen, una sola molécula de ADN del personal de laboratorio podría amplificarse y desorientar la investigación. Por lo tanto, las áreas de preparación de PCR están separadas del análisis o la purificación de otros productos de PCR, se utilizan utensilios de plástico desechables y la superficie de trabajo entre las configuraciones de reacción debe limpiarse a fondo.

La especificidad se puede ajustar mediante las condiciones experimentales de modo que no se generen productos espurios. Las técnicas de diseño de cebadores son importantes para mejorar el rendimiento del producto de PCR y evitar la formación de productos inespecíficos. El uso de componentes tampón alternativos o enzimas polimerasas puede ayudar con la amplificación de regiones largas o problemáticas de ADN. Por ejemplo, se dice que la polimerasa Q5 es ~280 veces menos propensa a errores que la polimerasa Taq. [19] [20] Tanto los parámetros de ejecución (por ejemplo, la temperatura y la duración de los ciclos) como la adición de reactivos, como la formamida , pueden aumentar la especificidad y el rendimiento de la PCR. [21] Se pueden realizar simulaciones por computadora de los resultados teóricos de la PCR ( PCR electrónica ) para ayudar en el diseño de cebadores. [22]

Aplicaciones

Aislamiento selectivo de ADN

La PCR permite aislar fragmentos de ADN del ADN genómico mediante la amplificación selectiva de una región específica de ADN. Este uso de la PCR permite muchas posibilidades, como la generación de sondas de hibridación para la hibridación Southern o Northern y la clonación de ADN , que requieren mayores cantidades de ADN, que representan una región específica de ADN. La PCR proporciona a estas técnicas grandes cantidades de ADN puro, lo que permite el análisis de muestras de ADN incluso a partir de cantidades muy pequeñas de material de partida. [ cita requerida ]

Otras aplicaciones de la PCR incluyen la secuenciación de ADN para determinar secuencias desconocidas amplificadas por PCR en las que uno de los cebadores de amplificación puede usarse en la secuenciación de Sanger , el aislamiento de una secuencia de ADN para acelerar las tecnologías de ADN recombinante que implican la inserción de una secuencia de ADN en un plásmido , fago o cósmido (según el tamaño) o el material genético de otro organismo. Las colonias bacterianas (como E. coli ) pueden examinarse rápidamente mediante PCR para detectar construcciones de vectores de ADN correctas . [23] La PCR también puede usarse para la huella genética ; una técnica forense utilizada para identificar a una persona u organismo comparando ADN experimental a través de diferentes métodos basados ​​en PCR. [ cita requerida ]

Electroforesis de fragmentos de ADN amplificados por PCR:
  1. Padre
  2. Niño
  3. Madre

El niño ha heredado algunas, pero no todas, las huellas dactilares de cada uno de sus padres, lo que le proporciona una huella dactilar nueva y única.

Algunos métodos de huellas dactilares de PCR tienen un alto poder discriminatorio y se pueden utilizar para identificar relaciones genéticas entre individuos, como padre-hijo o entre hermanos, y se utilizan en pruebas de paternidad (Fig. 4). Esta técnica también se puede utilizar para determinar relaciones evolutivas entre organismos cuando se utilizan ciertos relojes moleculares (es decir, los genes 16S rRNA y recA de los microorganismos). [24]

Amplificación y cuantificación del ADN

Debido a que la PCR amplifica las regiones de ADN a las que se dirige, la PCR se puede utilizar para analizar cantidades extremadamente pequeñas de muestra. Esto suele ser crítico para el análisis forense , cuando solo hay una cantidad traza de ADN disponible como evidencia. La PCR también se puede utilizar en el análisis de ADN antiguo que tiene decenas de miles de años. Estas técnicas basadas en PCR se han utilizado con éxito en animales, como un mamut de cuarenta mil años , y también en ADN humano, en aplicaciones que van desde el análisis de momias egipcias hasta la identificación de un zar ruso y el cuerpo del rey inglés Ricardo III . [25]

Los métodos de PCR cuantitativa o PCR en tiempo real (qPCR, [26] que no debe confundirse con RT-PCR ) permiten estimar la cantidad de una secuencia dada presente en una muestra, una técnica que se aplica a menudo para determinar cuantitativamente los niveles de expresión génica . La PCR cuantitativa es una herramienta establecida para la cuantificación del ADN que mide la acumulación de producto de ADN después de cada ronda de amplificación por PCR.

La qPCR permite cuantificar y detectar una secuencia específica de ADN en tiempo real, ya que mide la concentración mientras se lleva a cabo el proceso de síntesis. Existen dos métodos para la detección y cuantificación simultáneas. El primer método consiste en utilizar colorantes fluorescentes que se retienen de forma no específica entre las dobles hebras. El segundo método implica sondas que codifican secuencias específicas y están marcadas con fluorescencia. La detección de ADN mediante estos métodos solo se puede ver después de que se produzca la hibridación de las sondas con su ADN complementario (ADNc). Una combinación de técnicas interesante es la PCR en tiempo real y la transcripción inversa. Esta sofisticada técnica, llamada RT-qPCR, permite cuantificar una pequeña cantidad de ARN. A través de esta técnica combinada, el ARNm se convierte en ADNc, que se cuantifica aún más mediante qPCR. Esta técnica reduce la posibilidad de error en el punto final de la PCR, [27] aumentando las posibilidades de detección de genes asociados a enfermedades genéticas como el cáncer. [5] Los laboratorios utilizan la RT-qPCR con el fin de medir de forma sensible la regulación genética. Los fundamentos matemáticos para la cuantificación confiable de la PCR [28] y RT-qPCR [29] facilitan la implementación de procedimientos de ajuste precisos de datos experimentales en aplicaciones de investigación, médicas, de diagnóstico y de enfermedades infecciosas. [30] [31] [32] [33]

Aplicaciones médicas y de diagnóstico

Los futuros padres pueden ser sometidos a pruebas para detectar si son portadores genéticos , o sus hijos pueden ser sometidos a pruebas para detectar si realmente padecen una enfermedad . [2] Las muestras de ADN para pruebas prenatales se pueden obtener mediante amniocentesis , muestreo de vellosidades coriónicas o incluso mediante el análisis de células fetales raras que circulan en el torrente sanguíneo de la madre. El análisis de PCR también es esencial para el diagnóstico genético preimplantacional , donde se analizan las células individuales de un embrión en desarrollo para detectar mutaciones.

Aplicaciones en enfermedades infecciosas

La PCR permite un diagnóstico rápido y altamente específico de enfermedades infecciosas, incluidas aquellas causadas por bacterias o virus. [36] La PCR también permite la identificación de microorganismos no cultivables o de crecimiento lento como micobacterias , bacterias anaeróbicas o virus a partir de ensayos de cultivo de tejidos y modelos animales . La base de las aplicaciones de diagnóstico por PCR en microbiología es la detección de agentes infecciosos y la discriminación de cepas no patógenas de patógenas en virtud de genes específicos. [36] [37]

La caracterización y detección de organismos que provocan enfermedades infecciosas se ha revolucionado mediante PCR de las siguientes maneras:

Aplicaciones forenses

El desarrollo de protocolos de huellas genéticas (o de ADN ) basados ​​en PCR ha tenido una amplia aplicación en la ciencia forense :

Aplicaciones de investigación

La PCR se ha aplicado a muchas áreas de investigación en genética molecular:

Ventajas

La PCR tiene varias ventajas. Es bastante sencilla de entender y utilizar, y produce resultados rápidamente. La técnica es muy sensible y tiene el potencial de producir millones o miles de millones de copias de un producto específico para secuenciación, clonación y análisis. La qRT-PCR comparte las mismas ventajas que la PCR, con la ventaja añadida de la cuantificación del producto sintetizado. Por lo tanto, tiene sus usos para analizar alteraciones de los niveles de expresión génica en tumores, microbios u otros estados patológicos. [27]

La PCR es una herramienta de investigación muy potente y práctica. Gracias a ella se está descifrando la secuenciación de etiologías desconocidas de muchas enfermedades. Esta técnica puede ayudar a identificar la secuencia de virus previamente desconocidos relacionados con los ya conocidos y, de este modo, nos permite comprender mejor la enfermedad en sí. Si se puede simplificar aún más el procedimiento y desarrollar sistemas de detección sensibles no radiométricos, la PCR ocupará un lugar destacado en el laboratorio clínico durante los próximos años. [16]

Limitaciones

Una limitación importante de la PCR es que se necesita información previa sobre la secuencia objetivo para generar los cebadores que permitirán su amplificación selectiva. [27] Esto significa que, normalmente, los usuarios de PCR deben conocer la(s) secuencia(s) precisa(s) aguas arriba de la región objetivo en cada una de las dos plantillas monocatenarias para garantizar que la ADN polimerasa se una correctamente a los híbridos cebador-plantilla y posteriormente genere toda la región objetivo durante la síntesis de ADN. [ cita requerida ]

Como todas las enzimas, las ADN polimerasas también son propensas a errores, lo que a su vez provoca mutaciones en los fragmentos de PCR que se generan. [44]

Otra limitación de la PCR es que incluso la cantidad más pequeña de ADN contaminante puede ser amplificada, lo que da como resultado resultados engañosos o ambiguos. Para minimizar la posibilidad de contaminación, los investigadores deben reservar salas separadas para la preparación de reactivos, la PCR y el análisis del producto. Los reactivos deben dispensarse en alícuotas de un solo uso . Se deben utilizar de forma rutinaria pipetas con émbolos desechables y puntas de pipeta extralargas. [16] Además, se recomienda garantizar que la configuración del laboratorio siga un flujo de trabajo unidireccional. Ningún material o reactivo utilizado en las salas de PCR y análisis debe llevarse nunca a la sala de preparación de PCR sin una descontaminación completa. [45]

Las muestras ambientales que contienen ácidos húmicos pueden inhibir la amplificación por PCR y dar lugar a resultados inexactos. [ cita requerida ]

Variaciones

Historia

Representación esquemática de un par de cebadores de ejemplo. El uso de cebadores en un ensayo in vitro para permitir la síntesis de ADN fue una innovación importante que permitió el desarrollo de la PCR.

Las enzimas resistentes al calor, que son un componente clave en la reacción en cadena de la polimerasa, fueron descubiertas en la década de 1960 como producto de una forma de vida microbiana que vivía en las aguas sobrecalentadas del manantial Mushroom de Yellowstone . [81]

Un artículo de 1971 en el Journal of Molecular Biology escrito por Kjell Kleppe y sus colaboradores en el laboratorio de H. Gobind Khorana describió por primera vez un método de uso de un ensayo enzimático para replicar una plantilla corta de ADN con cebadores in vitro . [82] Sin embargo, esta manifestación temprana del principio básico de PCR no recibió mucha atención en ese momento y la invención de la reacción en cadena de la polimerasa en 1983 generalmente se atribuye a Kary Mullis . [83] [ página necesaria ]

"Baby Blue", un prototipo de máquina de 1986 para hacer PCR

Cuando Mullis desarrolló la PCR en 1983, trabajaba en Emeryville , California, para Cetus Corporation , una de las primeras empresas de biotecnología , donde era responsable de sintetizar cadenas cortas de ADN. Mullis ha escrito que concibió la idea de la PCR mientras conducía por la Pacific Coast Highway una noche en su coche. [84] Estaba jugando en su mente con una nueva forma de analizar los cambios (mutaciones) en el ADN cuando se dio cuenta de que, en cambio, había inventado un método para amplificar cualquier región del ADN a través de ciclos repetidos de duplicación impulsados ​​por la ADN polimerasa. En Scientific American , Mullis resumió el procedimiento: "Comenzando con una sola molécula del material genético ADN, la PCR puede generar 100 mil millones de moléculas similares en una tarde. La reacción es fácil de ejecutar. No requiere más que un tubo de ensayo, unos pocos reactivos simples y una fuente de calor". [85] La huella genética del ADN se utilizó por primera vez para las pruebas de paternidad en 1988. [86]

Mullis ha atribuido el uso del LSD a su desarrollo de la PCR: "¿Habría inventado la PCR si no hubiera tomado LSD? Lo dudo mucho. Podría sentarme sobre una molécula de ADN y ver pasar los polímeros. Aprendí eso en parte con las drogas psicodélicas". [87]

Mullis y el bioquímico Michael Smith , que habían desarrollado otras formas esenciales de manipular el ADN, [1] recibieron conjuntamente el Premio Nobel de Química en 1993, siete años después de que Mullis y sus colegas de Cetus pusieran en práctica por primera vez su propuesta. [88] El artículo de 1985 de Mullis con RK Saiki y HA Erlich, "Amplificación enzimática de secuencias genómicas de β-globina y análisis de sitios de restricción para el diagnóstico de anemia de células falciformes" (la invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)) fue honrado con un premio Citation for Chemical Breakthrough Award de la División de Historia de la Química de la Sociedad Química Estadounidense en 2017. [89] [2]

El método PCR se basa en el uso de una ADN polimerasa adecuada capaz de soportar las altas temperaturas de >90 °C (194 °F) requeridas para la separación de las dos cadenas de ADN en la doble hélice de ADN después de cada ciclo de replicación . Las ADN polimerasas empleadas inicialmente para los experimentos in vitro previos a la PCR no podían soportar estas altas temperaturas. [2] Por lo tanto, los primeros procedimientos para la replicación del ADN eran muy ineficientes y consumían mucho tiempo, y requerían grandes cantidades de ADN polimerasa y una manipulación continua durante todo el proceso.

El descubrimiento en 1976 de la Taq polimerasa —una ADN polimerasa purificada de la bacteria termófila Thermus aquaticus , que vive naturalmente en ambientes cálidos (50 a 80 °C (122 a 176 °F)) [14] como las fuentes termales— allanó el camino para mejoras espectaculares del método de PCR. La ADN polimerasa aislada de T. aquaticus es estable a altas temperaturas y permanece activa incluso después de la desnaturalización del ADN, [15] eliminando así la necesidad de añadir nueva ADN polimerasa después de cada ciclo. [3] Esto permitió un proceso automatizado basado en termociclador para la amplificación del ADN.

Disputas sobre patentes

La técnica PCR fue patentada por Kary Mullis y cedida a Cetus Corporation , donde Mullis trabajaba cuando inventó la técnica en 1983. La enzima Taq polimerasa también estaba cubierta por patentes. Ha habido varias demandas de alto perfil relacionadas con la técnica, incluida una demanda fallida [90] presentada por DuPont . La compañía farmacéutica suiza Hoffmann-La Roche compró los derechos de las patentes en 1992. La última de las patentes comerciales de PCR expiró en 2017. [91]

En varias jurisdicciones del mundo, Roche y Promega siguen en pie una batalla legal por la patente de la enzima Taq polimerasa . Los argumentos jurídicos se han extendido más allá de la vigencia de las patentes originales de la PCR y la polimerasa Taq , que expiraron el 28 de marzo de 2005. [92]

Véase también

Referencias

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