La electroforesis en gel de agarosa es un método de electroforesis en gel utilizado en bioquímica , biología molecular , genética y química clínica para separar una población mixta de macromoléculas como ADN o proteínas en una matriz de agarosa , uno de los dos componentes principales del agar . Las proteínas se pueden separar por carga y/o tamaño ( la electroforesis en agarosa con enfoque isoeléctrico es esencialmente independiente del tamaño) y los fragmentos de ADN y ARN por longitud. [1] Las biomoléculas se separan aplicando un campo eléctrico para mover las moléculas cargadas a través de una matriz de agarosa, y las biomoléculas se separan por tamaño en la matriz de gel de agarosa. [2]
El gel de agarosa es fácil de moldear, tiene relativamente menos grupos cargados y es particularmente adecuado para separar ADN de un rango de tamaños que se encuentra con mayor frecuencia en los laboratorios, lo que explica la popularidad de su uso. El ADN separado se puede ver con tinción, generalmente bajo luz ultravioleta, y los fragmentos de ADN se pueden extraer del gel con relativa facilidad. La mayoría de los geles de agarosa utilizados se disuelven entre un 0,7 y un 2 % en un tampón de electroforesis adecuado.
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El gel de agarosa es una matriz tridimensional formada por moléculas de agarosa helicoidales en haces superenrollados que se agregan en estructuras tridimensionales con canales y poros a través de los cuales pueden pasar las biomoléculas. [3] La estructura tridimensional se mantiene unida mediante enlaces de hidrógeno y, por lo tanto, se puede alterar calentándola hasta que vuelva a un estado líquido. La temperatura de fusión es diferente de la temperatura de gelificación; según las fuentes, el gel de agarosa tiene una temperatura de gelificación de 35 a 42 °C y una temperatura de fusión de 85 a 95 °C. También se encuentran disponibles agarosas de bajo punto de fusión y baja gelificación elaboradas mediante modificaciones químicas.
El gel de agarosa tiene un gran tamaño de poro y una buena resistencia del gel, lo que lo hace adecuado como un medio anticonvección para la electroforesis de ADN y moléculas de proteínas grandes. El tamaño de poro de un gel al 1% se ha estimado de 100 nm a 200-500 nm, [4] [5] y su resistencia del gel permite que los geles tan diluidos como 0,15% formen una placa para la electroforesis en gel. [6] Sin embargo, los geles de baja concentración (0,1-0,2%) son frágiles y, por lo tanto, difíciles de manipular. El gel de agarosa tiene un poder de resolución menor que el gel de poliacrilamida para el ADN, pero tiene un mayor rango de separación y, por lo tanto, se utiliza para fragmentos de ADN de tamaño generalmente de 50-20 000 pb. El límite de resolución para la electroforesis en gel de agarosa estándar es de alrededor de 750 kb, pero es posible una resolución de más de 6 Mb con la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). [7] También se puede utilizar para separar proteínas grandes y es la matriz preferida para la electroforesis en gel de partículas con radios efectivos mayores de 5-10 nm. Un gel de agarosa al 0,9% tiene poros lo suficientemente grandes para la entrada del bacteriófago T4 . [6]
El polímero de agarosa contiene grupos cargados, en particular piruvato y sulfato . [8] Estos grupos cargados negativamente crean un flujo de agua en la dirección opuesta al movimiento del ADN en un proceso llamado electroendosmosis (EEO), y por lo tanto pueden retardar el movimiento del ADN y causar el desenfoque de las bandas. Los geles de mayor concentración tendrían un mayor flujo electroendosmótico. Por lo tanto, la agarosa de bajo EEO generalmente se prefiere para su uso en la electroforesis en gel de agarosa de ácidos nucleicos , pero la agarosa de alto EEO puede usarse para otros fines. El menor contenido de sulfato de la agarosa de bajo EEO, particularmente la agarosa de bajo punto de fusión (LMP), también es beneficioso en los casos en que el ADN extraído del gel se va a utilizar para una mayor manipulación, ya que la presencia de sulfatos contaminantes puede afectar algunos procedimientos posteriores, como la ligadura y la PCR . Sin embargo, las agarosas de cero EEO no son deseables para algunas aplicaciones, ya que pueden fabricarse agregando grupos cargados positivamente y dichos grupos pueden afectar las reacciones enzimáticas posteriores. [9] La electroendosmosis es una de las razones por las que se prefiere el uso de agarosa en lugar de agar , ya que el componente agaropectina en el agar contiene una cantidad significativa de grupos sulfato y carboxilo con carga negativa. La eliminación de la agaropectina en la agarosa reduce sustancialmente la EEO, así como también reduce la adsorción no específica de biomoléculas a la matriz del gel. Sin embargo, para algunas aplicaciones, como la electroforesis de proteínas séricas, puede ser deseable una EEO alta, y se puede agregar agaropectina al gel utilizado. [10]
Varios factores pueden afectar la migración de ácidos nucleicos: la dimensión de los poros del gel (concentración del gel), el tamaño del ADN que se somete a electroforesis, el voltaje utilizado, la fuerza iónica del tampón y la concentración del colorante intercalante, como el bromuro de etidio, si se utiliza durante la electroforesis. [11]
Las moléculas más pequeñas viajan más rápido que las moléculas más grandes en el gel, y el ADN bicatenario se mueve a una velocidad que es inversamente proporcional al logaritmo del número de pares de bases. Sin embargo, esta relación se rompe con fragmentos de ADN muy grandes, y la separación de fragmentos de ADN muy grandes requiere el uso de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), que aplica corriente alterna desde diferentes direcciones y los fragmentos de ADN grandes se separan a medida que se reorientan con el campo cambiante. [12]
En el caso de la electroforesis en gel de agarosa estándar, las moléculas más grandes se separan mejor utilizando un gel de baja concentración, mientras que las moléculas más pequeñas se separan mejor con un gel de alta concentración. Sin embargo, los geles de mayor concentración requieren tiempos de ejecución más prolongados (a veces, días).
El movimiento del ADN puede verse afectado por la conformación de la molécula de ADN; por ejemplo, el ADN superenrollado suele moverse más rápido que el ADN relajado porque está fuertemente enrollado y, por lo tanto, es más compacto. En una preparación normal de ADN plasmídico, pueden estar presentes múltiples formas de ADN. [13] La electroforesis en gel de los plásmidos normalmente mostraría la forma superenrollada negativamente como la banda principal, mientras que el ADN mellado (forma circular abierta) y la forma circular cerrada relajada aparecen como bandas menores. Sin embargo, la velocidad a la que se mueven las distintas formas puede cambiar utilizando diferentes condiciones de electroforesis, [14] y la movilidad del ADN circular más grande puede verse más fuertemente afectada que la del ADN lineal por el tamaño de poro del gel. [15]
El bromuro de etidio que se intercala en el ADN circular puede cambiar la carga, la longitud y la superhelicidad de la molécula de ADN, por lo que su presencia en el gel durante la electroforesis puede afectar su movimiento. Por ejemplo, la carga positiva del bromuro de etidio puede reducir el movimiento del ADN en un 15 %. [12] La electroforesis en gel de agarosa se puede utilizar para resolver el ADN circular con diferentes topologías de superenrollamiento. [16]
El daño del ADN debido al aumento de la reticulación también reducirá la migración electroforética del ADN de una manera dependiente de la dosis. [17] [18]
La velocidad de migración del ADN es proporcional al voltaje aplicado, es decir, cuanto mayor sea el voltaje, más rápido se mueve el ADN. Sin embargo, la resolución de fragmentos grandes de ADN es menor a alto voltaje. La movilidad del ADN también puede cambiar en un campo inestable: en un campo que se invierte periódicamente, la movilidad del ADN de un tamaño particular puede disminuir significativamente a una frecuencia de ciclo particular. [4] Este fenómeno puede dar lugar a una inversión de banda en la electroforesis en gel con inversión de campo (FIGE), por la que los fragmentos de ADN más grandes se mueven más rápido que los más pequeños.
La carga negativa de su cadena principal de fosfato mueve el ADN hacia el ánodo cargado positivamente durante la electroforesis. Sin embargo, la migración de moléculas de ADN en solución, en ausencia de una matriz de gel, es independiente del peso molecular durante la electroforesis. [4] [20] Por lo tanto, la matriz de gel es responsable de la separación del ADN por tamaño durante la electroforesis, y existen varios modelos para explicar el mecanismo de separación de biomoléculas en la matriz de gel. Uno ampliamente aceptado es el modelo de Ogston que trata la matriz polimérica como un tamiz. Una proteína globular o un ADN en espiral aleatoria se mueve a través de los poros interconectados, y es más probable que el movimiento de moléculas más grandes se vea impedido y ralentizado por colisiones con la matriz de gel, y las moléculas de diferentes tamaños pueden, por lo tanto, separarse en este proceso de tamizado. [4]
Sin embargo, el modelo de Ogston no es válido para moléculas grandes, en las que los poros son significativamente más pequeños que el tamaño de la molécula. Para moléculas de ADN de tamaño superior a 1 kb, se utiliza con más frecuencia un modelo de reptación (o sus variantes). Este modelo supone que el ADN puede arrastrarse como una serpiente (de ahí la palabra "reptación") a través de los poros como una molécula alargada. Un modelo de reptación sesgado se aplica a una intensidad de campo eléctrico más alta, en la que el extremo delantero de la molécula se sesga fuertemente en la dirección hacia delante y tira del resto de la molécula. [21] Sin embargo, la microscopía de fluorescencia en tiempo real de moléculas teñidas mostró una dinámica más sutil durante la electroforesis, en la que el ADN muestra una elasticidad considerable al estirarse alternativamente en la dirección del campo aplicado y luego contraerse formando una bola, o engancharse en forma de U cuando queda atrapado en las fibras de polímero. [22] [23]
Los detalles de un experimento de electroforesis en gel de agarosa pueden variar según los métodos, pero la mayoría sigue un procedimiento general.
El gel se prepara disolviendo el polvo de agarosa en un tampón apropiado, como TAE o TBE , para su uso en la electroforesis. [12] La agarosa se dispersa en el tampón antes de calentarla hasta casi el punto de ebullición, pero evitando la ebullición. La agarosa fundida se deja enfriar lo suficiente antes de verter la solución en un molde, ya que el molde puede deformarse o agrietarse si la solución de agarosa está demasiado caliente. Se coloca un peine en el molde para crear pocillos para cargar la muestra, y el gel debe estar completamente fraguado antes de su uso.
La concentración del gel afecta la resolución de la separación del ADN. El gel de agarosa está compuesto de poros microscópicos a través de los cuales viajan las moléculas, y existe una relación inversa entre el tamaño de poro del gel de agarosa y la concentración: el tamaño de poro disminuye a medida que aumenta la densidad de las fibras de agarosa. Una alta concentración de gel mejora la separación de moléculas de ADN más pequeñas, mientras que una menor concentración de gel permite separar moléculas de ADN grandes. El proceso permite separar fragmentos que van desde 50 pares de bases hasta varias megabases, dependiendo de la concentración de gel utilizada. [24] La concentración se mide en peso de agarosa sobre volumen de tampón utilizado (g/ml). Para una electroforesis en gel de agarosa estándar, un gel al 0,8 % proporciona una buena separación o resolución de fragmentos de ADN grandes de 5 a 10 kb, mientras que un gel al 2 % proporciona una buena resolución para fragmentos pequeños de 0,2 a 1 kb. A menudo se utilizan geles al 1 % para una electroforesis estándar. [25] Los geles de alto porcentaje suelen ser frágiles y pueden no fraguar de manera uniforme, mientras que los geles de bajo porcentaje (0,1-0,2 %) son frágiles y no son fáciles de manipular. Los geles de agarosa de bajo punto de fusión (LMP) también son más frágiles que el gel de agarosa normal. La agarosa de bajo punto de fusión se puede utilizar sola o simultáneamente con agarosa estándar para la separación y aislamiento de ADN. [26] La PFGE y la FIGE a menudo se realizan con geles de agarosa de alto porcentaje.
Una vez que el gel se ha fijado, se retira el peine, dejando pocillos donde se pueden cargar las muestras de ADN. El tampón de carga se mezcla con la muestra de ADN antes de cargar la mezcla en los pocillos. El tampón de carga contiene un compuesto denso, que puede ser glicerol, sacarosa o Ficoll , que aumenta la densidad de la muestra para que la muestra de ADN pueda hundirse hasta el fondo del pocillo. [12] Si la muestra de ADN contiene etanol residual después de su preparación, puede flotar fuera del pocillo. El tampón de carga también incluye colorantes como xileno cianol y azul de bromofenol utilizados para controlar el progreso de la electroforesis. Las muestras de ADN se cargan utilizando una pipeta .
La electroforesis en gel de agarosa se realiza habitualmente en modo subacuático, en el que el gel en placa se sumerge completamente en el tampón durante la electroforesis. También es posible, aunque menos habitual, realizar la electroforesis en forma vertical, así como en forma horizontal con el gel elevado sobre patas de agarosa utilizando un aparato adecuado. [27] El tampón utilizado en el gel es el mismo que el tampón de funcionamiento en el tanque de electroforesis, por lo que es posible la electroforesis en modo subacuático con gel de agarosa.
Para una resolución óptima del ADN de más de 2 kb de tamaño en la electroforesis en gel estándar, se recomienda de 5 a 8 V/cm (la distancia en cm se refiere a la distancia entre electrodos, por lo tanto, este voltaje recomendado sería de 5 a 8 multiplicado por la distancia entre los electrodos en cm). [14] El voltaje también puede estar limitado por el hecho de que calienta el gel y puede hacer que el gel se derrita si se lo hace funcionar a alto voltaje durante un período prolongado, especialmente si el gel utilizado es un gel de agarosa LMP. Un voltaje demasiado alto también puede reducir la resolución, así como causar vetas de banda para moléculas de ADN grandes. Un voltaje demasiado bajo puede provocar el ensanchamiento de la banda para fragmentos de ADN pequeños debido a la dispersión y difusión. [28]
Como el ADN no es visible a la luz natural, el progreso de la electroforesis se controla con colorantes. El xileno cianol (color azul claro) comigra fragmentos de ADN grandes, mientras que el azul de bromofenol (azul oscuro) comigra con los fragmentos más pequeños. Los colorantes menos utilizados incluyen rojo cresol y naranja G que migran antes que el azul de bromofenol. También se ejecuta un marcador de ADN junto para la estimación del peso molecular de los fragmentos de ADN. Sin embargo, tenga en cuenta que el tamaño de un ADN circular como los plásmidos no se puede medir con precisión utilizando marcadores estándar a menos que se haya linealizado mediante digestión de restricción , alternativamente se puede utilizar un marcador de ADN superenrollado.
El ADN, así como el ARN, normalmente se visualizan mediante tinción con bromuro de etidio , que se intercala en los surcos principales del ADN y emite fluorescencia bajo luz ultravioleta. La intercalación depende de la concentración de ADN y, por lo tanto, una banda con alta intensidad indicará una mayor cantidad de ADN en comparación con una banda de menor intensidad. [12] El bromuro de etidio se puede agregar a la solución de agarosa antes de que se gelifique, o el gel de ADN se puede teñir más tarde después de la electroforesis. No es necesario desteñir el gel, pero puede producir mejores imágenes. Hay otros métodos de tinción disponibles; algunos ejemplos son MIDORI Green, SYBR Green , GelRed , azul de metileno , azul de cresilo brillante , sulfato azul del Nilo y violeta cristal . [29] SYBR Green, GelRed y otros productos comerciales similares se venden como alternativas más seguras al bromuro de etidio, ya que se ha demostrado que es mutagénico en la prueba de Ames , aunque en realidad no se ha establecido la carcinogenicidad del bromuro de etidio. SYBR Green requiere el uso de un transiluminador de luz azul. El ADN teñido con violeta de cristal se puede ver bajo luz natural sin el uso de un transiluminador UV, lo que es una ventaja, sin embargo, puede que no produzca una banda fuerte.
Cuando se tiñe con bromuro de etidio, el gel se observa con un transiluminador ultravioleta (UV). La luz ultravioleta excita los electrones dentro del anillo aromático del bromuro de etidio y, una vez que regresan al estado fundamental, se libera luz, lo que hace que el ADN y el complejo de bromuro de etidio emitan fluorescencia. [12] Los transiluminadores estándar utilizan longitudes de onda de 302/312 nm (UV-B), sin embargo, la exposición del ADN a la radiación ultravioleta durante tan solo 45 segundos puede producir daño al ADN y afectar los procedimientos posteriores, por ejemplo, reduciendo la eficiencia de la transformación , la transcripción in vitro y la PCR . [30] Por lo tanto, la exposición del ADN a la radiación ultravioleta debe limitarse. El uso de una longitud de onda más alta de 365 nm (rango UV-A) causa menos daño al ADN, pero también produce una fluorescencia mucho más débil con bromuro de etidio. Cuando se pueden seleccionar múltiples longitudes de onda en el transiluminador, se puede utilizar una longitud de onda más corta para capturar imágenes, mientras que se debe utilizar una longitud de onda más larga si es necesario trabajar en el gel durante un período de tiempo prolongado.
El aparato transiluminador también puede contener dispositivos de captura de imágenes, como una cámara digital o polaroid, que permiten tomar o imprimir una imagen del gel.
Para la electroforesis en gel de proteínas, las bandas pueden visualizarse con tinciones de Coomassie o plata .
Las bandas de ADN separadas se utilizan a menudo para procedimientos posteriores, y se puede extraer una banda de ADN del gel como una porción, disolverla y purificarla. Sin embargo, los contaminantes pueden afectar algunos procedimientos posteriores, como la PCR, y en algunos casos puede ser preferible la agarosa de bajo punto de fusión, ya que contiene menos sulfatos que pueden afectar algunas reacciones enzimáticas. Los geles también se pueden utilizar para técnicas de transferencia.
En general, el tampón ideal debe tener buena conductividad, producir menos calor y tener una larga vida. [31] Hay una serie de tampones utilizados para la electroforesis en agarosa; los más comunes para los ácidos nucleicos incluyen Tris/Acetato/EDTA (TAE) y Tris/Borato/EDTA (TBE). Los tampones utilizados contienen EDTA para inactivar muchas nucleasas que requieren un catión divalente para su función. El borato en el tampón TBE puede ser problemático ya que el borato puede polimerizar y/o interactuar con dioles cis como los que se encuentran en el ARN. TAE tiene la capacidad de amortiguación más baja, pero proporciona la mejor resolución para ADN más grande. Esto significa un voltaje más bajo y más tiempo, pero un mejor producto.
Se han propuesto muchos otros tampones, por ejemplo, borato de litio (LB), histidina isoeléctrica, tampones de productos con pK coincidente, etc.; en la mayoría de los casos, la justificación supuesta es una corriente más baja (menos calor) y/o movilidades iónicas coincidentes, lo que conduce a una vida útil más larga del tampón. El tampón tris-fosfato tiene una alta capacidad de amortiguación, pero no se puede utilizar si el ADN extraído se va a utilizar en una reacción sensible al fosfato. El LB es relativamente nuevo y es ineficaz para resolver fragmentos mayores de 5 kbp; sin embargo, con su baja conductividad, se podría utilizar un voltaje mucho más alto (hasta 35 V/cm), lo que significa un tiempo de análisis más corto para la electroforesis de rutina. Una diferencia de tamaño tan baja como un par de bases se podría resolver en un gel de agarosa al 3% con un medio de conductividad extremadamente baja (borato de litio 1 mM). [32]
Se pueden utilizar otros sistemas de amortiguación en aplicaciones específicas, por ejemplo, se pueden utilizar tampones de ácido barbitúrico-barbitúrico de sodio o de Tris- barbitúrico para la electroforesis de proteínas en gel de agarosa, por ejemplo para la detección de una distribución anormal de proteínas. [33]
Los geles de agarosa se moldean y manipulan con mayor facilidad que otras matrices y los ácidos nucleicos no se alteran químicamente durante la electroforesis. Las muestras también se recuperan con facilidad. Una vez finalizado el experimento, el gel resultante se puede almacenar en una bolsa de plástico en el refrigerador.
La electroforesis se realiza en soluciones tampón para reducir los cambios de pH debidos al campo eléctrico, lo cual es importante porque la carga del ADN y el ARN depende del pH, pero si se realiza durante demasiado tiempo se puede agotar la capacidad tampón de la solución. Además, es posible que las diferentes preparaciones de material genético no migren de manera uniforme entre sí, por razones morfológicas o de otro tipo.