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Edad de SDD

Ejemplo de un Western blot resultante después de la separación electroforética SDD-AGE, tinción con anticuerpos específicos

En bioquímica y biología molecular , SDD -AGE es la abreviatura de electroforesis en gel de agarosa detergente semidesnaturalizante . Este es un método para detectar y caracterizar polímeros proteicos grandes que son estables en SDS al 2% a temperatura ambiente , a diferencia de la mayoría de los complejos proteicos grandes . Este método es muy útil para estudiar priones y amiloides , que se caracterizan por la formación de polímeros proteicos . [1] [2] [3] [4] [5] [6] Se utiliza agarosa para el gel ya que los polímeros resistentes al SDS son grandes (en el rango de 200-4000+ kDa) y no pueden entrar en un gel de poliacrilamida convencional , que tiene poros pequeños. La agarosa, por otro lado, tiene poros grandes, lo que permite la separación de polímeros.

El uso de este método permitió a los investigadores comprender que al menos algunos tipos de agregados de priones existían en una estructura de dos niveles: moléculas de proteína agrupadas en polímeros, que son muy estables y resisten el tratamiento con SDS al 2% a temperatura ambiente, y agregados, que son haces de polímeros, que se disocian en estas condiciones.

Las diferencias en el tamaño de los polímeros pueden indicar la eficiencia de la fragmentación del polímero in vivo .

Historia

El método fue creado en el laboratorio de Genética Molecular del Instituto Ruso de Investigación Cardiológica y fue publicado en 2003 por Kryndushkin et al. [1] El método original utilizaba un sistema de tampón TAE e incorporaba un sistema de transferencia al vacío modificado para la transferencia de proteínas a una membrana (originalmente PVDF ). El sistema de transferencia al vacío modificado es en realidad una transferencia capilar asistida por vacío, ya que el vacío solo ayuda al fluido que ya ha pasado por el gel y la membrana a salir del sistema.

Variaciones

También se han utilizado otras modificaciones, como la descrita en Bagriantsev et al., [7] utilizando transferencia húmeda tradicional y un sistema de amortiguación TGB, y otras utilizando transferencia semiseca o transferencia capilar. [8]

DD-AGE, otra variación del método que utiliza condiciones totalmente desnaturalizantes (incluidos agentes reductores como ditiotreitol (DTT) y desnaturalización térmica a 95 °C), es adecuada para el análisis de cuerpos de inclusión termoestables de proteínas de poliglutamina . [9]

Referencias

  1. ^ ab Kryndushkin DS; Alexandrov IM; Ter-Avanesyan MD; Kushnirov VV (2003). "Los agregados de priones de levadura [PSI+] están formados por pequeños polímeros Sup35 fragmentados por Hsp104". Journal of Biological Chemistry . 278 (49): 49636–43. doi : 10.1074/jbc.M307996200 . PMID  14507919.
  2. ^ Salnikova AB; Kryndushkin DS; Smirnov VN; Kushnirov VV; Ter-Avanesyan MD (2005). "La supresión sin sentido en células de levadura que sobreproducen Sup35 (eRF3) es causada por sus amiloides no hereditarios". Journal of Biological Chemistry . 280 (10): 8808–12. doi : 10.1074/jbc.M410150200 . PMID  15618222.
  3. ^ Meriin AB; Zhang X; Alexandrov IM; Salnikova AB; Ter-Avanesian MD; Chernoff YO; Sherman MY (2007). "La maquinaria de endocitosis está involucrada en la agregación de proteínas con dominios de poliglutamina expandidos". FASEB Journal . 21 (8): 1915–25. doi : 10.1096/fj.06-6878com . PMID  17341688. S2CID  24922939.
  4. ^ Shkundina IS; Kushnirov VV; Tuite MF; Ter-Avanesyan MD (2006). "El papel de las repeticiones de oligopéptidos N-terminales de la proteína priónica Sup35 de levadura en la propagación y transmisión de variantes priónicas". Genética . 172 (2): 827–35. doi :10.1534/genetics.105.048660. PMC 1456247 . PMID  16272413. 
  5. ^ Alexandrov IM; Vishnevskaya AB; Ter-Avanesyan MD; Kushnirov VV (2008). "Aparición y propagación de amiloides basados ​​en poliglutamina en levadura: los residuos de tirosina permiten la fragmentación del polímero". Journal of Biological Chemistry . 283 (22): 15185–92. doi : 10.1074/jbc.M802071200 . PMC 2397454 . PMID  18381282. 
  6. ^ Alberti S; Halfmann R; King O; Kapila A; Lindquist S (2009). "Un estudio sistemático identifica priones y arroja luz sobre las características de secuencia de las proteínas prionogénicas". Cell . 137 (1): 146–58. doi :10.1016/j.cell.2009.02.044. PMC 2683788 . PMID  19345193. 
  7. ^ Bagriantsev SN; Kushnirov VV; Liebman SW (2006). "Análisis de agregados de amiloide mediante electroforesis en gel de agarosa". Amiloide, priones y otros agregados proteicos, parte B. Métodos en enzimología. Vol. 412. págs. 33–48. doi :10.1016/S0076-6879(06)12003-0. ISBN 9780121828172. Número de identificación personal  17046650.
  8. ^ Halfmann R; Lindquist S (2008). "Detección de la agregación amiloide mediante electroforesis en gel de agarosa con detergente semidesnaturalizante". Journal of Visualized Experiments (17). doi :10.3791/838. PMC 2723713. PMID  19066511 . 
  9. ^ Weber JJ; Golla M; Guaitoli G; Wanichawan P; Hayer SN; Hauser S; Krahl AC; Nagel M; Samer S; Aronica E; Carlson CR; Schöls L; Riess O; Gloeckner CJ; Nguyen HP; Hübener-Schmid J (2017). "Un enfoque combinatorio para identificar sitios de escisión de calpaína en la proteína ataxina-3 de la enfermedad de Machado-Joseph". Cerebro . 140 (5): 1280–1299. doi : 10.1093/brain/awx039 . PMID  28334907.