La electroforesis en gel de poliacrilamida ( PAGE ) es una técnica muy utilizada en bioquímica , química forense , genética , biología molecular y biotecnología para separar macromoléculas biológicas , normalmente proteínas o ácidos nucleicos , según su movilidad electroforética . La movilidad electroforética es función de la longitud, conformación y carga de la molécula. La electroforesis en gel de poliacrilamida es una herramienta poderosa que se utiliza para analizar muestras de ARN. Cuando el gel de poliacrilamida se desnaturaliza después de la electroforesis, proporciona información sobre la composición de la muestra de las especies de ARN. [1]
La hidratación del acrilonitrilo da como resultado la formación de moléculas de acrilamida ( C 3 H 5 NO ) por la nitrilo hidratasa . [2] El monómero de acrilamida se encuentra en estado de polvo antes de la adición de agua. La acrilamida es tóxica para el sistema nervioso humano, por lo que se deben seguir todas las medidas de seguridad al trabajar con ella. La acrilamida es soluble en agua y, tras la adición de iniciadores de radicales libres, se polimeriza dando como resultado la formación de poliacrilamida. [2] Es útil preparar gel de poliacrilamida mediante hidratación con acrilamida porque el tamaño de los poros se puede regular. Las concentraciones elevadas de acrilamida dan como resultado una disminución del tamaño de los poros después de la polimerización. El gel de poliacrilamida con poros pequeños ayuda a examinar mejor las moléculas más pequeñas, ya que las moléculas pequeñas pueden entrar en los poros y viajar a través del gel, mientras que las moléculas grandes quedan atrapadas en las aberturas de los poros.
Como ocurre con todas las formas de electroforesis en gel , las moléculas pueden procesarse en su estado nativo , preservando su estructura de orden superior. Este método se llama PÁGINA nativa. Alternativamente, se puede agregar un desnaturalizante químico para eliminar esta estructura y convertir la molécula en una molécula no estructurada cuya movilidad depende sólo de su longitud (porque todos los complejos proteína-SDS tienen una relación masa-carga similar). Este procedimiento se llama SDS-PAGE . La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) es un método para separar moléculas basándose en la diferencia de su peso molecular. Al pH al que se lleva a cabo la electroforesis en gel, las moléculas de SDS están cargadas negativamente y se unen a las proteínas en una proporción determinada, aproximadamente una molécula de SDS por cada 2 aminoácidos. [3] : 164–79 De esta manera, el detergente proporciona a todas las proteínas una relación carga-masa uniforme. Al unirse a las proteínas, el detergente destruye su estructura secundaria, terciaria y/o cuaternaria, desnaturalizándolas y convirtiéndolas en cadenas polipeptídicas lineales cargadas negativamente. Cuando se someten a un campo eléctrico en PAGE, las cadenas polipeptídicas cargadas negativamente viajan hacia el ánodo con diferente movilidad. Su movilidad, o la distancia recorrida por las moléculas, es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. [4] Al comparar la relación relativa de la distancia recorrida por cada proteína con la longitud del gel (Rf), se pueden sacar conclusiones sobre el peso molecular relativo de las proteínas, donde la longitud del gel está determinada por la distancia recorrida por una pequeña molécula como un tinte de seguimiento. [5]
Para los ácidos nucleicos, la urea es el desnaturalizante más utilizado. Para las proteínas, el dodecilsulfato de sodio (SDS) es un detergente aniónico que se aplica a muestras de proteínas para recubrirlas con el fin de impartir dos cargas negativas (de cada molécula de SDS) a cada dos aminoácidos de la proteína desnaturalizada. [3] : 161–3 El 2-mercaptoetanol también se puede utilizar para romper los enlaces disulfuro que se encuentran entre los complejos proteicos, lo que ayuda a desnaturalizar aún más la proteína. En la mayoría de las proteínas, la unión de SDS a las cadenas polipeptídicas imparte una distribución uniforme de carga por unidad de masa, lo que resulta en un fraccionamiento por tamaño aproximado durante la electroforesis. Las proteínas que tienen un mayor contenido hidrófobo (por ejemplo, muchas proteínas de membrana y aquellas que interactúan con tensioactivos en su entorno nativo) son intrínsecamente más difíciles de tratar con precisión utilizando este método, debido a la mayor variabilidad en la proporción de SDS unido. [6] Desde el punto de vista procesal, se puede usar Native y SDS-PAGE juntos para purificar y separar las distintas subunidades de la proteína. Native-PAGE mantiene intacta la forma oligomérica y mostrará una banda en el gel que es representativa del nivel de actividad. SDS-PAGE desnaturalizará y separará la forma oligomérica en sus monómeros, mostrando bandas que son representativas de sus pesos moleculares. Estas bandas se pueden utilizar para identificar y evaluar la pureza de la proteína. [3] : 161-3
Las muestras pueden ser cualquier material que contenga proteínas o ácidos nucleicos. Estos pueden derivarse biológicamente, por ejemplo de células, tejidos, virus, muestras ambientales o proteínas purificadas procariotas o eucariotas. En el caso de células o tejidos sólidos, estos a menudo se descomponen primero mecánicamente usando un mezclador (para volúmenes de muestra más grandes), usando un homogeneizador (volúmenes más pequeños), mediante un sonicador o usando ciclos de alta presión, y una combinación de métodos bioquímicos y Se pueden utilizar técnicas mecánicas, incluidos varios tipos de filtración y centrifugación , para separar diferentes compartimentos celulares y orgánulos antes de la electroforesis. También se pueden utilizar como analitos biomoléculas sintéticas tales como oligonucleótidos .
La muestra a analizar se mezcla opcionalmente con un desnaturalizante químico si así se desea, normalmente SDS para proteínas o urea para ácidos nucleicos. El SDS es un detergente aniónico que desnaturaliza las estructuras secundarias y terciarias sin enlaces disulfuro y, además, aplica una carga negativa a cada proteína en proporción a su masa. La urea rompe los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases del ácido nucleico, provocando que las cadenas constituyentes se separen. Calentar las muestras a al menos 60 °C promueve aún más la desnaturalización. [7] [8] [9] [10]
Además del SDS, las proteínas pueden opcionalmente calentarse brevemente hasta casi hervir en presencia de un agente reductor, como ditiotreitol (DTT) o 2-mercaptoetanol (beta-mercaptoetanol/BME) , que desnaturaliza aún más las proteínas al reducir los enlaces disulfuro. superando así algunas formas de plegamiento de proteínas terciarias y rompiendo la estructura de las proteínas cuaternarias (subunidades oligoméricas). Esto se conoce como reducción de SDS-PAGE.
Se puede agregar un tinte de seguimiento a la solución. Por lo general, tiene una movilidad electroforética más alta que los analitos para permitir al experimentador seguir el progreso de la solución a través del gel durante la ejecución electroforética.
Los geles suelen consistir en acrilamida , bisacrilamida , el desnaturalizante opcional (SDS o urea) y un tampón con un pH ajustado. La solución se puede desgasificar al vacío para evitar la formación de burbujas de aire durante la polimerización. Alternativamente, se puede agregar butanol al gel de resolución (para proteínas) después de verterlo, ya que el butanol elimina las burbujas y suaviza la superficie. [11] Se añaden una fuente de radicales libres y un estabilizador, como persulfato de amonio y TEMED para iniciar la polimerización. [12] La reacción de polimerización crea un gel debido a la bisacrilamida agregada , que puede formar enlaces cruzados entre dos moléculas de acrilamida. La proporción de bisacrilamida a acrilamida se puede variar para fines especiales, pero generalmente es aproximadamente 1 parte en 35. La concentración de acrilamida del gel también se puede variar, generalmente en el intervalo de 5% a 25%. Los geles con porcentajes más bajos son mejores para resolver moléculas de peso molecular muy alto, mientras que se necesitan porcentajes mucho más altos de acrilamida para resolver proteínas más pequeñas. El diámetro de poro promedio de los geles de poliacrilamida está determinado por la concentración total de acrilamidas (% T con T = concentración total de acrilamida y bisacrilamida) y la concentración del reticulante bisacrilamida (% C con C = concentración de bisacrilamida). [13] El tamaño de los poros se reduce recíprocamente al %T. Respecto al %C, una concentración del 5% produce los poros más pequeños, ya que la influencia de la bisacrilamida en el tamaño de los poros tiene forma de parábola con un vértice en el 5%.
Los geles generalmente se polimerizan entre dos placas de vidrio en un molde para gel, con un peine insertado en la parte superior para crear los pocillos de muestra. Una vez polimerizado el gel, se puede retirar el peine y el gel está listo para la electroforesis.
En PAGE se utilizan varios sistemas tampón según la naturaleza de la muestra y el objetivo experimental. Los amortiguadores utilizados en el ánodo y el cátodo pueden ser iguales o diferentes. [9] [14] [15]
Se aplica un campo eléctrico a través del gel, lo que hace que las proteínas o ácidos nucleicos cargados negativamente migren a través del gel lejos del electrodo negativo (que es el cátodo, ya que se trata de una celda electrolítica en lugar de galvánica) y hacia el electrodo positivo (el ánodo). Dependiendo de su tamaño, cada biomolécula se mueve de manera diferente a través de la matriz del gel: las moléculas pequeñas caben más fácilmente a través de los poros del gel, mientras que las más grandes tienen más dificultades. El gel suele funcionar durante unas horas, aunque esto depende del voltaje aplicado a través del gel; La migración se produce más rápidamente a voltajes más altos, pero estos resultados suelen ser menos precisos que los de voltajes más bajos. Después del tiempo establecido, las biomoléculas han migrado diferentes distancias según su tamaño. Las biomoléculas más pequeñas viajan más abajo en el gel, mientras que las más grandes permanecen más cerca del punto de origen. Por lo tanto, las biomoléculas se pueden separar aproximadamente según el tamaño, que depende principalmente del peso molecular en condiciones desnaturalizantes, pero también depende de la conformación de orden superior en condiciones nativas. La movilidad del gel se define como la tasa de migración recorrida con un gradiente de voltaje de 1 V/cm y tiene unidades de cm 2 /seg/V. [3] : 161–3 Para fines analíticos, la movilidad relativa de las biomoléculas, R f , la relación entre la distancia que la molécula viajó en el gel y la distancia total recorrida de un tinte de seguimiento se representa versus el peso molecular de la molécula ( o, a veces, el log de MW, o más bien el Mr , radio molecular). Estos gráficos típicamente lineales representan los marcadores estándar o curvas de calibración que se utilizan ampliamente para la estimación cuantitativa de una variedad de tamaños biomoleculares. [3] : 161-3
Ciertas glicoproteínas , sin embargo, se comportan de forma anómala en geles de SDS. Además, el análisis de proteínas más grandes, entre 250.000 y 600.000 Da, también resulta problemático debido al hecho de que dichos polipéptidos se mueven incorrectamente en los sistemas de gel utilizados normalmente. [dieciséis]
Después de la electroforesis, el gel se puede teñir (para proteínas, más comúnmente con azul brillante de Coomassie R-250 o autorradiografía; para ácidos nucleicos, bromuro de etidio ; o para cualquiera de los dos, tinción de plata ), lo que permite la visualización de las proteínas separadas, o se puede procesar más ( por ejemplo , transferencia Western ). Después de la tinción, las biomoléculas de diferentes especies aparecen como bandas distintas dentro del gel. Es común ejecutar marcadores de tamaño de peso molecular de peso molecular conocido en un carril separado en el gel para calibrar el gel y determinar la masa molecular aproximada de biomoléculas desconocidas comparando la distancia recorrida con respecto al marcador.
Para las proteínas, SDS-PAGE suele ser la primera opción como ensayo de pureza debido a su fiabilidad y facilidad. La presencia de SDS y el paso de desnaturalización hacen que las proteínas se separen, aproximadamente según el tamaño, pero puede ocurrir una migración aberrante de algunas proteínas. Diferentes proteínas también pueden teñirse de manera diferente, lo que interfiere con la cuantificación mediante tinción. PAGE también se puede utilizar como técnica preparativa para la purificación de proteínas. Por ejemplo, la PAGE nativa preparativa es un método para separar metaloproteínas nativas en matrices biológicas complejas.
El gel de poliacrilamida (PAG) se conocía como un posible medio de inclusión para seccionar tejidos ya en 1964, y dos grupos independientes emplearon PAG en electroforesis en 1959. [17] [18] Posee varias características electroforéticamente deseables que lo convierten en un medio versátil. . Es un gel sintético, termoestable, transparente, fuerte, químicamente relativamente inerte y puede prepararse con una amplia gama de tamaños de poro promedio. [19] El tamaño de poro de un gel y la reproducibilidad del tamaño de poro del gel están determinados por tres factores: la cantidad total de acrilamida presente (%T) (T = concentración total de acrilamida y monómero de bisacrilamida), la cantidad de reticulante (%C) (C = concentración de bisacrilamida) y el tiempo de polimerización de la acrilamida (cf. QPNC-PAGE). El tamaño de los poros disminuye al aumentar el %T; con reticulación, el 5%C proporciona el tamaño de poro más pequeño. Cualquier aumento o disminución en %C desde 5% aumenta el tamaño de poro, ya que el tamaño de poro con respecto a %C es una función parabólica con vértice en 5%C. Esto parece deberse a una agrupación no homogénea de hebras de polímero dentro del gel. Este material de gel también puede soportar gradientes de alto voltaje , es susceptible de diversos procedimientos de tinción y decoloración y puede digerirse para extraer fracciones separadas o secarse para autorradiografía y registro permanente.
Los geles de poliacrilamida se componen de un gel apilable y un gel separador. Los geles apilables tienen una mayor porosidad en relación con el gel separador y permiten que las proteínas migren en un área concentrada. Además, los geles apilables suelen tener un pH de 6,8, ya que las moléculas neutras de glicina permiten una movilidad de proteínas más rápida. Los geles separadores tienen un pH de 8,8, donde la glicina aniónica ralentiza la movilidad de las proteínas. Los geles separadores permiten la separación de proteínas y tienen una porosidad relativamente menor. Aquí, las proteínas se separan según el tamaño (en SDS-PAGE) y el tamaño/carga (PAGE nativa). [20]
El tampón químico estabiliza el valor del pH al valor deseado dentro del propio gel y en el tampón de electroforesis. La elección del tampón influye también en la movilidad electroforética de los contraiones del tampón y, por tanto, en la resolución del gel. El tampón tampoco debe ser reactivo y no modificarse ni reaccionar con la mayoría de las proteínas. Se pueden utilizar diferentes buffers como buffers de cátodo y ánodo, respectivamente, dependiendo de la aplicación. Se pueden usar múltiples valores de pH dentro de un solo gel, por ejemplo en electroforesis DISC. Los tampones comunes en PAGE incluyen Tris , Bis-Tris o imidazol .
El contraión equilibra la carga intrínseca del ion tampón y también afecta la intensidad del campo eléctrico durante la electroforesis. Los iones móviles y altamente cargados a menudo se evitan en los tampones catódicos de SDS-PAGE, pero pueden incluirse en el propio gel, donde migran antes que la proteína. En aplicaciones como DISC SDS-PAGE, los valores de pH dentro del gel pueden variar para cambiar la carga promedio de los contraiones durante la ejecución para mejorar la resolución. Los contraiones populares son la glicina y la tricina . La glicina se ha utilizado como fuente de iones de arrastre o iones lentos porque su pKa es 9,69 y la movilidad del glicinato es tal que la movilidad efectiva se puede establecer en un valor inferior al de las proteínas más lentas conocidas de carga negativa neta en el rango de pH. El pH mínimo de este rango es aproximadamente 8,0.
Acrilamida ( C 3 H 5 NO ; mW: 71,08) cuando se disuelve en agua, se produce una autopolimerización lenta y espontánea de la acrilamida, uniendo las moléculas cabeza con cola para formar polímeros largos de cadena sencilla. La presencia de un sistema generador de radicales libres acelera enormemente la polimerización. Este tipo de reacción se conoce como polimerización por adición de vinilo . Una solución de estas cadenas poliméricas se vuelve viscosa pero no forma un gel, porque las cadenas simplemente se deslizan unas sobre otras. La formación de gel requiere unir varias cadenas. La acrilamida es cancerígena , [21] una neurotoxina y una toxina reproductiva. [22] También es esencial almacenar la acrilamida en un lugar fresco, oscuro y seco para reducir la autopolimerización y la hidrólisis .
La bisacrilamida ( N , N ′-metilenbisacrilamida ) ( C 7 H 10 N 2 O 2 ; mW: 154,17) es el agente reticulante más utilizado para geles de poliacrilamida. Químicamente se puede considerar como dos moléculas de acrilamida acopladas cabeza con cabeza en sus extremos no reactivos. La bisacrilamida puede reticular dos cadenas de poliacrilamida entre sí, formando así un gel.
El dodecilsulfato de sodio (SDS) ( C 12 H 25 NaO 4 S ; mW: 288,38) (solo se usa en geles de proteínas desnaturalizantes) es un agente detergente fuerte que se usa para desnaturalizar proteínas nativas en polipéptidos individuales . Esta desnaturalización, que se conoce como desnaturalización reconstructiva, no se logra mediante la linealización total de la proteína, sino mediante un cambio conformacional a una combinación de estructuras secundarias de hélice α y espiral aleatoria. [6] Cuando una mezcla de proteínas se calienta a 100 °C en presencia de SDS, el detergente envuelve la columna vertebral del polipéptido. Se une a polipéptidos en una proporción en peso constante de 1,4 g de SDS/g de polipéptido. En este proceso, las cargas intrínsecas de los polipéptidos se vuelven insignificantes en comparación con las cargas negativas aportadas por el SDS. Así, los polipéptidos después del tratamiento se convierten en estructuras en forma de varilla que poseen una densidad de carga uniforme, es decir, la misma carga negativa neta por unidad de peso. La movilidad electroforética de estas proteínas es una función lineal de los logaritmos de sus pesos moleculares. Sin SDS, diferentes proteínas con pesos moleculares similares migrarían de manera diferente debido a diferencias en la relación masa-carga, ya que cada proteína tiene un punto isoeléctrico y un peso molecular particulares a su estructura primaria . Esto se conoce como PÁGINA nativa . Agregar SDS resuelve este problema, ya que se une y despliega la proteína, dando una carga negativa casi uniforme a lo largo del polipéptido.
La urea ( CO(NH 2 ) 2 ; mW: 60,06) es un agente caotrópico que aumenta la entropía del sistema al interferir con las interacciones intramoleculares mediadas por fuerzas no covalentes como los enlaces de hidrógeno y las fuerzas de van der Waals . La estructura macromolecular depende del efecto neto de estas fuerzas, por lo que se deduce que un aumento de solutos caotrópicos desnaturaliza las macromoléculas.
El persulfato de amonio (APS) ( N 2 H 8 S 2 O 8 ; mW: 228,2) es una fuente de radicales libres y se utiliza a menudo como iniciador para la formación de gel. Una fuente alternativa de radicales libres es la riboflavina , que generó radicales libres en una reacción fotoquímica .
TEMED ( N , N , N ′, N ′-tetrametiletilendiamina) ( C 6 H 16 N 2 ; mW: 116,21) estabiliza los radicales libres y mejora la polimerización. La velocidad de polimerización y las propiedades del gel resultante dependen de las concentraciones de radicales libres. El aumento de la cantidad de radicales libres da como resultado una disminución en la longitud promedio de la cadena del polímero, un aumento en la turbidez del gel y una disminución en la elasticidad del gel. Disminuir la cantidad muestra el efecto inverso. Se deben utilizar las concentraciones catalíticas más bajas que permitan la polimerización en un período de tiempo razonable. APS y TEMED se utilizan normalmente en concentraciones aproximadamente equimolares en el intervalo de 1 a 10 mM.
Los siguientes productos químicos y procedimientos se utilizan para procesar el gel y las muestras de proteínas visualizadas en él.
Tinte de seguimiento; Como las proteínas y los ácidos nucleicos son en su mayoría incoloros, no es fácil seguir su avance a través del gel durante la electroforesis. Por lo tanto, normalmente se incluyen colorantes aniónicos de movilidad electroforética conocida en el tampón de muestra PAGE. Un tinte de seguimiento muy común es el azul de bromofenol (BPB, 3',3",5',5" tetrabromofenolsulfonftaleína). Este tinte tiene color a pH alcalino y neutro y es una pequeña molécula cargada negativamente que se mueve hacia el ánodo . Al ser una molécula muy móvil, se adelanta a la mayoría de las proteínas. Cuando llega al extremo anódico del medio de electroforesis, se detiene la electroforesis. Puede unirse débilmente a algunas proteínas y dar un color azul. Otros tintes de seguimiento comunes son el xileno cianol , que tiene menor movilidad, y el Orange G , que tiene una mayor movilidad.
Ayudas de carga; la mayoría de los sistemas PAGE se cargan desde la parte superior en los pocillos dentro del gel. Para garantizar que la muestra se hunda hasta el fondo del gel, el tampón de muestra se complementa con aditivos que aumentan la densidad de la muestra. Estos aditivos deben ser no iónicos y no reactivos con las proteínas para evitar interferir con la electroforesis. Los aditivos comunes son el glicerol y la sacarosa .
El azul brillante de Coomassie R-250 (CBB) ( C 45 H 44 N 3 NaO 7 S 2 ; mW: 825,97) es el tinte de proteínas más popular. Es un colorante aniónico que se une de forma no específica a las proteínas. La estructura del CBB es predominantemente no polar y generalmente se usa en solución metanólica acidificada con ácido acético. Las proteínas del gel se fijan con ácido acético y se tiñen simultáneamente. El exceso de tinte incorporado al gel se puede eliminar decolorando con la misma solución sin tinte. Las proteínas se detectan como bandas azules sobre un fondo claro. Como el SDS también es aniónico, puede interferir con el proceso de tinción. Por lo tanto, se recomienda un gran volumen de solución de tinción, al menos diez veces el volumen del gel.
El bromuro de etidio (EtBr) es una tinción de ácido nucleico popular. EtBr permite visualizar fácilmente ADN o ARN en un gel, ya que EtBr emite un color naranja fluorescente bajo luz ultravioleta. [23] El bromuro de etidio se une a las cadenas de ácidos nucleicos mediante el proceso de intercalación. [3] Si bien el bromuro de etidio es un tinte popular, es importante tener cuidado al utilizar EtBr, ya que es un carcinógeno conocido . Debido a este hecho, muchos investigadores optan por utilizar tintes como SYBR Green y SYBR Safe, que son alternativas más seguras al EtBr. [24] EtBr se utiliza simplemente agregándolo a la mezcla de gel. Una vez que el gel ha corrido, se puede ver mediante el uso de un sistema de documentación fotográfica. [3]
La tinción con plata se utiliza cuando se necesita un método de detección más sensible, ya que la tinción clásica con azul brillante de Coomassie generalmente puede detectar una banda de proteína de 50 ng. La tinción con plata aumenta la sensibilidad generalmente entre 10 y 100 veces más. Esto se basa en la química del revelado fotográfico. Las proteínas se fijan al gel con una solución diluida de metanol y luego se incuban con una solución ácida de nitrato de plata. Los iones de plata se reducen a su forma metálica mediante formaldehído a pH alcalino. Una solución ácida, como el ácido acético, detiene el desarrollo. [25] Kerenyi y Gallyas introdujeron la tinción con plata como un procedimiento sensible para detectar trazas de proteínas en geles . [26] La técnica se ha extendido al estudio de otras macromoléculas biológicas que han sido separadas en una variedad de soportes. [27] Muchas variables pueden influir en la intensidad del color y cada proteína tiene sus propias características de tinción; Cristalería limpia, reactivos puros y agua de la más alta pureza son los puntos clave para una tinción exitosa. [28] La tinción con plata se desarrolló en el siglo XIV para colorear la superficie del vidrio. Se ha utilizado ampliamente con este fin desde el siglo XVI. El color producido por las primeras manchas de plata oscilaba entre el amarillo claro y el rojo anaranjado. Camillo Golgi perfeccionó la tinción con plata para el estudio del sistema nervioso . El método de Golgi tiñe un número limitado de células al azar en su totalidad. [29]
La autorradiografía, que también se utiliza para la detección de bandas de proteínas después de la electroforesis en gel, utiliza isótopos radiactivos para marcar proteínas, que luego se detectan mediante una película de rayos X. [30]
La transferencia Western es un proceso mediante el cual las proteínas separadas en el gel de acrilamida se transfieren electroforéticamente a una membrana estable y manipulable, como una membrana de nitrocelulosa , nailon o PVDF . Entonces es posible aplicar técnicas inmunoquímicas para visualizar las proteínas transferidas, así como identificar con precisión aumentos o disminuciones relativas de la proteína de interés.
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