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La agarosa es un heteropolisacárido , generalmente extraído de ciertas algas rojas . [1] Es un polímero lineal formado por la unidad repetitiva de agarobiosa, que es un disacárido formado por D -galactosa y 3,6-anhidro- L -galactopiranosa. [2] [3] La agarosa es uno de los dos componentes principales del agar , y se purifica a partir del agar eliminando el otro componente del agar, la agaropectina . [4]
La agarosa se utiliza con frecuencia en biología molecular para la separación de moléculas grandes, especialmente ADN , mediante electroforesis . Las placas de gel de agarosa (normalmente al 0,7-2 %) para electroforesis se preparan fácilmente vertiendo la solución líquida tibia en un molde. Existe una amplia gama de agarosas diferentes de distintos pesos moleculares y propiedades disponibles comercialmente para este propósito. La agarosa también se puede formar en perlas y utilizar en varios métodos cromatográficos para la purificación de proteínas .
La agarosa es un polímero lineal con un peso molecular de aproximadamente 120.000, que consiste en D - galactosa y 3,6-anhidro- L -galactopiranosa alternadas unidas por enlaces glucosídicos α-(1→3) y β-(1→4). La 3,6-anhidro- L -galactopiranosa es una L -galactosa con un puente anhidro entre las posiciones 3 y 6, aunque algunas unidades de L -galactosa en el polímero pueden no contener el puente. Algunas unidades de D -galactosa y L -galactosa pueden estar metiladas , y también se encuentran piruvato y sulfato en pequeñas cantidades. [5]
Cada cadena de agarosa contiene ~800 moléculas de galactosa, y las cadenas de polímero de agarosa forman fibras helicoidales que se agregan en una estructura superenrollada con un radio de 20-30 nanómetros (nm). [6] Las fibras son cuasi-rígidas y tienen un amplio rango de longitud dependiendo de la concentración de agarosa. [7] Cuando se solidifican, las fibras forman una malla tridimensional de canales de diámetro que varía de 50 nm a >200 nm dependiendo de la concentración de agarosa utilizada - concentraciones más altas producen diámetros de poro promedio más bajos. La estructura 3-D se mantiene unida con enlaces de hidrógeno y por lo tanto puede romperse calentándola nuevamente a un estado líquido.
La agarosa está disponible como un polvo blanco que se disuelve en agua casi hirviendo y forma un gel cuando se enfría. La agarosa exhibe el fenómeno de histéresis térmica en su transición de líquido a gel, es decir, se gelifica y se funde a diferentes temperaturas. Las temperaturas de gelificación y fusión varían según el tipo de agarosa. Las agarosas estándar derivadas de Gelidium tienen una temperatura de gelificación de 34-38 °C (93-100 °F) y una temperatura de fusión de 90-95 °C (194-203 °F), mientras que las derivadas de Gracilaria , debido a sus sustituyentes metoxi más altos , tienen una temperatura de gelificación de 40-52 °C (104-126 °F) y una temperatura de fusión de 85-90 °C (185-194 °F). [8] Las temperaturas de fusión y gelificación pueden depender de la concentración del gel, particularmente a una concentración de gel baja de menos del 1%. Por lo tanto, las temperaturas de gelificación y fusión se dan a una concentración de agarosa específica.
La agarosa natural contiene grupos metilo sin carga y el grado de metilación es directamente proporcional a la temperatura de gelificación. Sin embargo, la metilación sintética tiene el efecto inverso, por el cual una mayor metilación reduce la temperatura de gelificación. [9] Existe una variedad de agarosas modificadas químicamente con diferentes temperaturas de fusión y gelificación mediante modificaciones químicas.
La agarosa en el gel forma una malla que contiene poros, y el tamaño de los poros depende de la concentración de agarosa añadida. Al reposar, los geles de agarosa son propensos a la sinéresis (extrusión de agua a través de la superficie del gel), pero el proceso es lo suficientemente lento como para no interferir con el uso del gel. [10] [11]
El gel de agarosa puede tener una alta resistencia de gel a baja concentración, lo que lo hace adecuado como un medio anticonvección para la electroforesis en gel . Los geles de agarosa tan diluidos como 0,15% pueden formar placas para la electroforesis en gel. [12] El polímero de agarosa contiene grupos cargados, en particular piruvato y sulfato . [9] Estos grupos cargados negativamente pueden ralentizar el movimiento de las moléculas de ADN en un proceso llamado electroendosmosis (EEO).
Por lo tanto, la agarosa de bajo EEO (LE) generalmente se prefiere para su uso en la electroforesis en gel de agarosa de ácidos nucleicos . También se encuentran disponibles agarosas de cero EEO, pero pueden ser indeseables para algunas aplicaciones, ya que pueden prepararse agregando grupos con carga positiva que pueden afectar las reacciones enzimáticas posteriores. [13] La electroendosmosis es una razón por la que se usa agarosa preferentemente sobre agar, ya que la agaropectina en agar contiene una cantidad significativa de grupos sulfato y carboxilo con carga negativa. La eliminación de agaropectina en agarosa reduce sustancialmente el EEO, así como también reduce la adsorción no específica de biomoléculas a la matriz del gel. Sin embargo, para algunas aplicaciones, como la electroforesis de proteínas séricas, puede ser deseable un alto EEO, y se puede agregar agaropectina al gel utilizado. [14]
Se dice que la agarosa LE es mejor para la electroforesis preparativa, es decir, cuando es necesario extraer ADN de un gel de agarosa. [15]
Las temperaturas de fusión y gelificación de la agarosa se pueden modificar mediante modificaciones químicas, más comúnmente mediante hidroxietilación, que reduce el número de enlaces de hidrógeno intracatenarios, lo que da como resultado temperaturas de fusión y solidificación más bajas en comparación con las agarosas estándar. [16] La temperatura exacta está determinada por el grado de sustitución, y muchas agarosas de bajo punto de fusión (LMP) disponibles pueden permanecer fluidas en un rango de 30 a 35 °C (86 a 95 °F). Esta propiedad permite realizar manipulaciones enzimáticas directamente después de la electroforesis en gel de ADN agregando rebanadas de gel fundido que contienen el fragmento de ADN de interés a una mezcla de reacción. La agarosa LMP contiene menos sulfatos que pueden afectar algunas reacciones enzimáticas y, por lo tanto, se usa preferiblemente para algunas aplicaciones.
La agarosa hidroxietilada también tiene un tamaño de poro más pequeño (~90 nm) que las agarosas estándar. [17] La hidroxietilación puede reducir el tamaño de poro al reducir la densidad de empaquetamiento de los haces de agarosa, por lo tanto, el gel LMP también puede tener un efecto en el tiempo y la separación durante la electroforesis. [18] Las agarosas de temperatura de fusión o gelificación ultrabaja pueden gelificarse solo a 8–15 °C (46–59 °F).
La agarosa es una matriz preferida para trabajar con proteínas y ácidos nucleicos ya que tiene un amplio rango de estabilidad física, química y térmica, y su menor grado de complejidad química también hace que sea menos probable que interactúe con biomoléculas . La agarosa se usa más comúnmente como medio para la separación electroforética a escala analítica en la electroforesis en gel de agarosa . Los geles hechos de agarosa purificada tienen un tamaño de poro relativamente grande, lo que los hace útiles para la separación de moléculas grandes, como proteínas y complejos proteicos >200 kilodaltons, así como fragmentos de ADN >100 pares de bases. La agarosa también se usa ampliamente para una serie de otras aplicaciones, por ejemplo, inmunodifusión e inmunoelectroforesis , ya que las fibras de agarosa pueden funcionar como ancla para inmunocomplejos .
La electroforesis en gel de agarosa es el método de rutina para la resolución de ADN en el laboratorio. Los geles de agarosa tienen un poder de resolución para el ADN menor que los geles de acrilamida , pero tienen un mayor rango de separación y, por lo tanto, se utilizan generalmente para fragmentos de ADN con longitudes de 50-20 000 pb ( pares de bases ), aunque es posible una resolución de más de 6 Mb con la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). [19] También se puede utilizar para separar moléculas de proteínas grandes y es la matriz preferida para la electroforesis en gel de partículas con radios efectivos mayores de 5-10 nm. [12]
El tamaño de poro del gel afecta el tamaño del ADN que se puede tamizar. Cuanto menor sea la concentración del gel, mayor será el tamaño de poro y mayor será el ADN que se puede tamizar. Sin embargo, los geles de baja concentración (0,1 - 0,2%) son frágiles y, por lo tanto, difíciles de manejar, y la electroforesis de moléculas de ADN grandes puede tardar varios días. El límite de resolución para la electroforesis en gel de agarosa estándar es de alrededor de 750 kb. [19] Este límite se puede superar mediante PFGE, donde se aplican campos eléctricos ortogonales alternados al gel. Los fragmentos de ADN se reorientan cuando el campo aplicado cambia de dirección, pero las moléculas de ADN más grandes tardan más en realinearse cuando se altera el campo eléctrico, mientras que para las más pequeñas es más rápido, y el ADN, por lo tanto, se puede fraccionar según el tamaño.
Los geles de agarosa se vierten en un molde y, cuando se fijan, generalmente se deslizan horizontalmente sumergidos en una solución tampón. Los tampones Tris-acetato-EDTA y Tris-borato-EDTA se utilizan comúnmente, pero otros tampones como Tris-fosfato, ácido barbitúrico-barbitúrico sódico o tampones Tris- barbitúrico se pueden utilizar en otras aplicaciones. [1] El ADN normalmente se visualiza tiñéndolo con bromuro de etidio y luego se observa bajo una luz ultravioleta , pero hay otros métodos de tinción disponibles, como SYBR Green , GelRed , azul de metileno y violeta cristal . Si los fragmentos de ADN separados se necesitan para experimentos posteriores, se pueden cortar del gel en rodajas para su posterior manipulación.
La matriz de gel de agarosa se utiliza a menudo para la purificación de proteínas , por ejemplo, en la separación a escala preparativa basada en columnas como en la cromatografía de filtración en gel , la cromatografía de afinidad y la cromatografía de intercambio iónico . Sin embargo, no se utiliza como un gel continuo, sino que se forma en perlas porosas o resinas de diversa finura. [20] Las perlas son muy porosas para que la proteína pueda fluir libremente a través de ellas. Estas perlas a base de agarosa son generalmente blandas y se trituran fácilmente, por lo que deben utilizarse en procedimientos de flujo por gravedad, centrifugación a baja velocidad o baja presión. [21] La resistencia de las resinas se puede mejorar aumentando la reticulación y el endurecimiento químico de las resinas de agarosa, sin embargo, dichos cambios también pueden dar como resultado una menor capacidad de unión de las proteínas en algunos procedimientos de separación como la cromatografía de afinidad .
La agarosa es un material útil para la cromatografía porque no absorbe biomoléculas en un grado significativo, tiene buenas propiedades de flujo y puede tolerar extremos de pH y fuerza iónica , así como altas concentraciones de desnaturalizantes como urea 8M o guanidina HCl 6M . [22] Ejemplos de matriz basada en agarosa para cromatografía de filtración en gel son Sepharose y WorkBeads 40 SEC (agarosa en perlas reticulada), Praesto y Superose (agarosas en perlas altamente reticuladas) y Superdex ( dextrano unido covalentemente a agarosa).
Para la cromatografía de afinidad, la agarosa en perlas es la resina matriz más utilizada para la unión de los ligandos que se unen a las proteínas. [23] Los ligandos se unen covalentemente a través de un espaciador a los grupos hidroxilo activados del polímero de perlas de agarosa. Las proteínas de interés pueden luego unirse selectivamente a los ligandos para separarlas de otras proteínas, después de lo cual pueden eluirse. Las perlas de agarosa utilizadas suelen tener densidades del 4% y 6% con una alta capacidad de unión a las proteínas.
En ocasiones, se puede utilizar una placa de agarosa en lugar de agar para cultivar organismos, ya que el agar puede contener impurezas que pueden afectar el crecimiento del organismo o algunos procedimientos posteriores, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La agarosa también es más dura que el agar y, por lo tanto, puede ser preferible cuando se necesita una mayor fuerza de gel, y su temperatura de gelificación más baja puede evitar causar un choque térmico al organismo cuando las células se suspenden en líquido antes de la gelificación. Se puede utilizar para el cultivo de bacterias autótrofas estrictas, protoplastos de plantas , [24] Caenorhabditis elegans , [25] otros organismos y varias líneas celulares.
A veces se utiliza agarosa en lugar de agar para medir la motilidad y movilidad de los microorganismos. Las especies móviles podrán migrar, aunque lentamente, a través del gel poroso y luego se pueden visualizar las tasas de infiltración. La porosidad del gel está directamente relacionada con la concentración de agar o agarosa en el medio, por lo que se pueden utilizar geles de diferentes concentraciones para evaluar la motilidad de natación , enjambre , deslizamiento y espasmo de una célula. El ensayo de migración celular bajo agarosa se puede utilizar para medir la quimiotaxis y la quimiocinesis. Se coloca una capa de gel de agarosa entre una población celular y un quimioatrayente . A medida que se desarrolla un gradiente de concentración a partir de la difusión del quimioatrayente en el gel, se pueden visualizar a lo largo del tiempo varias poblaciones celulares que requieren diferentes niveles de estimulación para migrar mediante microfotografía a medida que hacen un túnel hacia arriba a través del gel contra la gravedad a lo largo del gradiente.