El isoelectroenfoque ( IEF ), también conocido como electroenfoque , es una técnica para separar diferentes moléculas por diferencias en su punto isoeléctrico (pI). [1] [2] Es un tipo de electroforesis en zona que se realiza habitualmente sobre proteínas en un gel y que aprovecha el hecho de que la carga total de la molécula de interés es una función del pH de su entorno. [3]
La IEF implica la adición de una solución de anfólito en geles de gradiente de pH inmovilizado (IPG). Los IPG son la matriz de gel de acrilamida copolimerizada con el gradiente de pH, lo que da como resultado gradientes completamente estables, excepto los valores de pH más alcalinos (>12). El gradiente de pH inmovilizado se obtiene mediante el cambio continuo en la proporción de inmobilinas . Una inmobilina es un ácido o base débil definido por su valor de pK.
Una proteína que se encuentra en una región de pH por debajo de su punto isoeléctrico (pI) tendrá carga positiva y, por lo tanto, migrará hacia el cátodo (electrodo con carga negativa). Sin embargo, a medida que migra a través de un gradiente de pH creciente, la carga general de la proteína disminuirá hasta que alcance la región de pH que corresponde a su pI. En este punto, no tiene carga neta y, por lo tanto, la migración cesa (ya que no hay atracción eléctrica hacia ninguno de los electrodos). Como resultado, las proteínas se concentran en bandas estacionarias nítidas y cada proteína se ubica en un punto del gradiente de pH que corresponde a su pI. La técnica es capaz de lograr una resolución extremadamente alta, ya que las proteínas que difieren en una sola carga se fraccionan en bandas separadas.
Las moléculas que se van a enfocar se distribuyen sobre un medio que tiene un gradiente de pH (generalmente creado por anfolitos alifáticos ). Se hace pasar una corriente eléctrica a través del medio, creando un extremo de ánodo "positivo" y un extremo de cátodo "negativo ". Las moléculas con carga negativa migran a través del gradiente de pH en el medio hacia el extremo "positivo", mientras que las moléculas con carga positiva se mueven hacia el extremo "negativo". A medida que una partícula se mueve hacia el polo opuesto de su carga, se mueve a través del gradiente de pH cambiante hasta que alcanza un punto en el que se alcanza el pH del punto isoeléctrico de esa molécula. En este punto, la molécula ya no tiene una carga eléctrica neta (debido a la protonación o desprotonación de los grupos funcionales asociados) y, como tal, no avanzará más dentro del gel. El gradiente se establece antes de agregar las partículas de interés sometiendo primero una solución de moléculas pequeñas, como polianfolitos con valores de pI variables, a electroforesis.
El método se aplica con especial frecuencia en el estudio de proteínas , que se separan en función de su contenido relativo de residuos ácidos y básicos , cuyo valor está representado por el pI. Las proteínas se introducen en un gel de gradiente de pH inmovilizado compuesto de poliacrilamida , almidón o agarosa donde se ha establecido un gradiente de pH. Los geles con poros grandes se utilizan habitualmente en este proceso para eliminar cualquier efecto de "tamizado" o artefactos en el pI causados por diferentes tasas de migración para proteínas de diferentes tamaños. El enfoque isoeléctrico puede resolver proteínas que difieren en el valor de pI en tan solo 0,01. [4] El enfoque isoeléctrico es el primer paso en la electroforesis en gel bidimensional , en la que las proteínas se separan primero por su valor de pI y luego se separan aún más por peso molecular a través de SDS-PAGE . El enfoque isoeléctrico, por otro lado, es el único paso en la PAGE nativa preparativa a pH constante. [5]
Según algunas opiniones, [6] [7] las células eucariotas vivas realizan el enfoque isoeléctrico de las proteínas en su interior para superar una limitación de la velocidad de la reacción metabólica por difusión de enzimas y sus reactantes, y para regular la velocidad de procesos bioquímicos particulares. Al concentrar las enzimas de vías metabólicas particulares en regiones distintas y pequeñas de su interior, la célula puede aumentar la velocidad de vías bioquímicas particulares en varios órdenes de magnitud. Mediante la modificación del punto isoeléctrico (pI) de las moléculas de una enzima mediante, por ejemplo, fosforilación o desfosforilación, la célula puede transferir moléculas de la enzima entre diferentes partes de su interior, para activar o desactivar procesos bioquímicos particulares.
La electroforesis basada en microchip es una alternativa prometedora a la electroforesis capilar , ya que tiene el potencial de proporcionar un análisis rápido de proteínas, una integración sencilla con otras operaciones unitarias de microfluidos, detección de canales completos, películas de nitrocelulosa, tamaños de muestra más pequeños y menores costos de fabricación.
La creciente demanda de herramientas de separación de proteínas más rápidas y fáciles de usar ha acelerado la evolución de la IEF hacia separaciones en solución. En este contexto, se desarrolló un sistema IEF de unión múltiple para realizar separaciones IEF rápidas y sin gel. El sistema IEF de unión múltiple utiliza una serie de recipientes con un capilar que pasa a través de cada recipiente. [8] Parte del capilar en cada recipiente se reemplaza por una membrana semipermeable. Los recipientes contienen soluciones tampón con diferentes valores de pH, de modo que se establece efectivamente un gradiente de pH dentro del capilar. La solución tampón en cada recipiente tiene un contacto eléctrico con un divisor de voltaje conectado a una fuente de alimentación de alto voltaje, que establece un campo eléctrico a lo largo del capilar. Cuando se inyecta una muestra (una mezcla de péptidos o proteínas) en el capilar, la presencia del campo eléctrico y el gradiente de pH separa estas moléculas de acuerdo con sus puntos isoeléctricos. El sistema IEF de múltiples uniones se ha utilizado para separar mezclas de péptidos tripsídicos para proteómica bidimensional [9] y proteínas del plasma sanguíneo de pacientes con enfermedad de Alzheimer para el descubrimiento de biomarcadores. [8]