Forma de electroforesis en gel utilizada para analizar proteínas.
Geles 2D (teñidos con Coomassie)En los laboratorios modernos se utilizan robots para aislar manchas de proteínas de geles 2D.
La electroforesis en gel bidimensional , abreviada como 2-DE o electroforesis 2-D , es una forma de electroforesis en gel que se utiliza habitualmente para analizar proteínas . Las mezclas de proteínas se separan mediante dos propiedades en dos dimensiones en geles 2D. La 2-DE fue introducida por primera vez de forma independiente por O'Farrell [1] y Klose [2] en 1975.
Base para la separación
La electroforesis en 2D comienza con la electroforesis en la primera dimensión y luego separa las moléculas perpendicularmente a la primera para crear un electroferograma en la segunda dimensión. En la electroforesis en la primera dimensión, las moléculas se separan linealmente según su punto isoeléctrico. En la segunda dimensión, las moléculas se separan a 90 grados del primer electroferograma según la masa molecular. Dado que es poco probable que dos moléculas sean similares en dos propiedades distintas, las moléculas se separan de manera más efectiva en la electroforesis en 2D que en la electroforesis en 1D. [ cita requerida ]
Las dos dimensiones en las que se separan las proteínas utilizando esta técnica pueden ser el punto isoeléctrico , la masa del complejo proteico en el estado nativo o la masa de la proteína . [ cita requerida ]
La separación por punto isoeléctrico se denomina isoelectroenfoque . De esta manera, se aplica un gradiente de pH a un gel y se aplica un potencial eléctrico a través del gel, haciendo que un extremo sea más positivo que el otro. En todos los valores de pH distintos de su punto isoeléctrico, las proteínas estarán cargadas. Si están cargadas positivamente, serán atraídas hacia el extremo más negativo del gel y si están cargadas negativamente, serán atraídas hacia el extremo más positivo del gel. Las proteínas aplicadas en la primera dimensión se moverán a lo largo del gel y se acumularán en su punto isoeléctrico; es decir, el punto en el que la carga total de la proteína es 0 (una carga neutra).
La separación por masa de complejo proteico se realiza mediante PAGE nativo , en el que las proteínas permanecen en su estado nativo y se separan en el campo eléctrico siguiendo su masa y la masa de sus complejos respectivamente. Para obtener una separación por tamaño y no por carga neta, como en IEF, se transfiere una carga adicional a las proteínas mediante el uso de azul brillante de Coomassie o dodecil sulfato de litio. El conocimiento del complejo proteico es importante para el análisis del funcionamiento de las proteínas en una célula , ya que las proteínas en su mayoría actúan juntas en complejos para ser completamente funcionales. El análisis de esta organización de suborgánulos de la célula requiere técnicas que conserven el estado nativo de los complejos proteicos .
La separación solo por masa se logra comúnmente mediante SDS-PAGE . SDS desnaturaliza las proteínas, desintegra la mayoría de los complejos e iguala aproximadamente las relaciones masa-carga. SDS debe realizarse como la segunda dimensión perpendicular, ya que desintegra los complejos (lo que hace imposible la PAGE nativa) e iguala las relaciones masa-carga (lo que hace imposible la IEF).
Detección de proteínas
El resultado es un gel con proteínas esparcidas sobre su superficie. Estas proteínas pueden detectarse por diversos medios, pero las tinciones más utilizadas son la tinción con plata y la tinción con azul brillante de Coomassie. En el primer caso, se aplica un coloide de plata al gel. La plata se une a los grupos de cisteína dentro de la proteína. La plata se oscurece con la exposición a la luz ultravioleta. La cantidad de plata puede relacionarse con la oscuridad y, por lo tanto, con la cantidad de proteína en una ubicación determinada del gel. Esta medición solo puede dar cantidades aproximadas, pero es adecuada para la mayoría de los propósitos. La tinción con plata es 100 veces más sensible que la tinción con azul brillante de Coomassie, con un rango de linealidad de 40 veces. [3]
Las moléculas que no sean proteínas se pueden separar mediante electroforesis 2D. En los ensayos de superenrollamiento , el ADN enrollado se separa en la primera dimensión y se desnaturaliza mediante un intercalador de ADN (como el bromuro de etidio o la cloroquina , menos cancerígena ) en la segunda. Esto es comparable a la combinación de PAGE/SDS-PAGE nativos en la separación de proteínas. [ cita requerida ]
Técnicas comunes
IPG-DALT
Una técnica común es utilizar un gradiente de pH inmovilizado (IPG) en la primera dimensión. Esta técnica se conoce como IPG-DALT . La muestra se separa primero en un gel de IPG (que está disponible comercialmente) y luego el gel se corta en rodajas para cada muestra que luego se equilibra en SDS-mercaptoetanol y se aplica a un gel SDS-PAGE para su resolución en la segunda dimensión. Normalmente, el IPG-DALT no se utiliza para la cuantificación de proteínas debido a la pérdida de componentes de bajo peso molecular durante la transferencia al gel SDS-PAGE. [4]
Deformación: imágenes de dos geles de electroforesis 2D, superpuestos con Delta2D. La primera imagen está coloreada en naranja, la segunda en azul. Debido a las diferencias de ejecución, los puntos correspondientes no se superponen.Deformación: imágenes de dos geles de electroforesis 2D después de la deformación. La primera imagen está coloreada en naranja, la segunda en azul. Los puntos correspondientes se superponen después de la deformación. Los puntos comunes están coloreados en negro, los puntos naranjas solo están presentes (o son mucho más fuertes) en la primera imagen, los puntos azules solo están presentes (o son mucho más fuertes) en la segunda imagen.
En la proteómica cuantitativa , estas herramientas analizan principalmente biomarcadores cuantificando proteínas individuales y mostrando la separación entre uno o más "puntos" de proteína en una imagen escaneada de un gel 2-DE. Además, estas herramientas combinan puntos entre geles de muestras similares para mostrar, por ejemplo, diferencias proteómicas entre etapas tempranas y avanzadas de una enfermedad. Los paquetes de software incluyen Delta2D (descontinuado), ImageMaster (descontinuado), Melanie, PDQuest (descontinuado), SameSpots y REDFIN, entre otros. [ cita requerida ] Si bien esta tecnología se utiliza ampliamente, la inteligencia no se ha perfeccionado. Por ejemplo, si bien PDQuest y SameSpots tienden a coincidir en la cuantificación y el análisis de puntos de proteína bien definidos y bien separados, brindan diferentes resultados y tendencias de análisis con puntos menos definidos y menos separados. [5] Anteriormente se han publicado estudios comparativos para orientar a los investigadores sobre el "mejor" software para su análisis. [6] Aunque normalmente se utiliza para la electroforesis en gel estándar , Sciugo también se puede utilizar para la creación y cuantificación de figuras. [ cita requerida ]
Los desafíos para el análisis automático basado en software incluyen puntos separados de forma incompleta (superpuestos) (menos definidos o separados), puntos débiles/ruido (por ejemplo, "puntos fantasma"), diferencias de ejecución entre geles (por ejemplo, la proteína migra a diferentes posiciones en diferentes geles), puntos no coincidentes/no detectados, lo que lleva a valores faltantes , [7] [8] puntos no coincidentes, errores en la cuantificación (el software puede detectar erróneamente varios puntos distintos como un solo punto y partes de un punto pueden excluirse de la cuantificación) y diferencias en los algoritmos del software y, por lo tanto, tendencias de análisis.
Las listas de selección generadas se pueden exportar desde algunos paquetes de software [9] y se pueden utilizar para la digestión automatizada en gel de manchas de proteínas y la posterior identificación de las proteínas mediante espectrometría de masas . El análisis por espectrometría de masas puede identificar mediciones de masa precisas junto con la secuenciación de péptidos que varían de 1000 a 4000 unidades de masa atómica. [10]
Para obtener una descripción general del enfoque actual para el análisis de software de imágenes de gel 2DE, consulte Berth et al. [11] o Bandow et al. [12]
^ O'Farrell, PH (1975). "Electroforesis bidimensional de proteínas de alta resolución". J. Biol. Chem . 250 (10): 4007–21. doi : 10.1016/S0021-9258(19)41496-8 . PMC 2874754. PMID 236308 .
^ Klose, J (1975). "Mapeo de proteínas mediante la combinación de isoelectroenfoque y electroforesis de tejidos de ratón. Un nuevo enfoque para la prueba de mutaciones puntuales inducidas en mamíferos" . Humangenetik . 26 (3): 231–43. doi :10.1007/bf00281458. PMID 1093965. S2CID 30981877.
^ Switzer RC 3rd, Merril CR, Shifrin S (1979). "Una tinción de plata altamente sensible para detectar proteínas y péptidos en geles de poliacrilamida". Analytical Biochemistry . 98 (1): 231–37. doi :10.1016/0003-2697(79)90732-2. PMID 94518.
^ Mikkelsen, Susan; Corton, Eduardo (2004). Química Bioanalítica . John Wiley & Sons, Inc. pág. 224.ISBN978-0-471-62386-1.
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^ Kang, Yunyi; Techanukul, Tanasit; Mantalaris, Anthanasios; Nagy, Judit M. (febrero de 2009). "Comparación de tres paquetes de software de análisis DIGE disponibles comercialmente: mínima intervención del usuario en proteómica basada en gel". Journal of Proteome Research . 8 (2): 1077–1084. doi :10.1021/pr800588f. ISSN 1535-3893. PMID 19133722.
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^¿ Qué son los valores faltantes y por qué son un problema?
^ "Software de análisis proteómico mediante electroforesis en gel 2D | SameSpots". TotalLab . Consultado el 8 de julio de 2024 .
^ Lepedda, Antonio J, y Marilena Formato. "Aplicaciones de la tecnología de electroforesis bidimensional al estudio de la aterosclerosis". EJIFCC vol. 19,3 146–159. 20 de diciembre de 2008
^ Berth M, Moser FM, Kolbe M, Bernhardt J (octubre de 2007). "El estado del arte en el análisis de imágenes de electroforesis en gel bidimensional". Appl. Microbiol. Biotechnol . 76 (6): 1223–43. doi :10.1007/s00253-007-1128-0. PMC 2279157. PMID 17713763 .
^ Bandow JE, Baker JD, Berth M, et al. (agosto de 2008). "Un flujo de trabajo de análisis de imágenes mejorado para geles 2-D permite estudios proteómicos a gran escala basados en geles 2-D: estudio de descubrimiento de biomarcadores de EPOC". Proteomics . 8 (15): 3030–41. doi :10.1002/pmic.200701184. PMID 18618493. S2CID 206361897.
