La etapa de digestión en gel es una parte de la preparación de la muestra para la identificación espectrométrica de masas de proteínas durante el análisis proteómico . El método fue introducido en 1992 por Rosenfeld. [1] Se han realizado innumerables modificaciones y mejoras en los elementos básicos del procedimiento. [2] [3] [4] [5] [6] [7]
El paso de digestión en gel comprende principalmente cuatro pasos: decoloración, reducción y alquilación (R&A) de las cisteínas en la proteína, escisión proteolítica de la proteína y extracción de los péptidos generados .
Las proteínas que se separaron mediante electroforesis en gel unidimensional o bidimensional se visualizan habitualmente mediante tinción con colorantes como el azul brillante de Coomassie (CBB) o plata . Aunque la sensibilidad del método es significativamente menor, el uso de Coomassie es más común para las muestras destinadas a la espectrometría de masas, ya que la tinción con plata perjudica el análisis. Después de la escisión de la banda de proteína de interés del gel, la mayoría de los protocolos requieren una decoloración de las proteínas antes de continuar.
La solución de decoloración para CBB contiene generalmente la sal tampón bicarbonato de amonio (NH4HCO3 ) y una fracción de 30%-50% de disolvente orgánico (principalmente acetonitrilo ). Las interacciones hidrofóbicas entre la proteína y CBB se reducen por la fracción orgánica de la solución. [8] Al mismo tiempo, la parte iónica de la solución disminuye los enlaces electrostáticos entre el colorante y los aminoácidos cargados positivamente de la proteína. En contraste con una mezcla de agua con disolvente orgánico, la efectividad de la decoloración aumenta. Un aumento de la temperatura promueve el proceso de decoloración. [9] Hasta cierto grado (<10%) el procedimiento de decoloración va acompañado de una pérdida de proteína. [10] Además, la eliminación de CBB no afecta el rendimiento de los péptidos en la medición espectrométrica de masas. [7] [11]
En el caso de bandas de proteína teñidas con plata, la decoloración se logra mediante la oxidación de la plata metálica unida a la proteína mediante ferricianuro de potasio o peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ). [12] [13] Los iones de plata liberados se complejan posteriormente con tiosulfato de sodio .
La tinción y decoloración de los geles suele ir seguida de la reducción y alquilación (r&a) de las cistinas o cisteínas de las proteínas. De este modo, los enlaces disulfuro de las proteínas se rompen de forma irreversible y se obtiene el despliegue óptimo de la estructura terciaria . La reducción al tiol se consigue mediante la reacción con productos químicos que contienen grupos sulfhidrilo o fosfina, como el ditiotreitol (DTT) o el clorhidrato de tris-2-carboxietilfosfina (TCEP). En el curso de la alquilación irreversible posterior de los grupos SH con yodoacetamida, las cisteínas se transforman en la estable S-carboxiamidometilcisteína (CAM; aducto: -CH2 - CONH2 ) . De este modo, el peso molecular del residuo de aminoácido cisteína aumenta de 103,01 Da a 160,03 Da.
La reducción y alquilación de residuos de cisteína mejora el rendimiento del péptido y la cobertura de la secuencia y la identificación de proteínas con un alto número de enlaces disulfuro. [14] [15] Debido a la rareza del aminoácido cisteína para la mayoría de las proteínas, el paso de r&a no produce ninguna mejora en el análisis espectrométrico de masas. [5] [10] [16] [17] Para la alquilación cuantitativa y homogénea de cisteínas, la posición del paso de modificación en el proceso de preparación de la muestra es crucial. Con la electroforesis desnaturalizante se recomienda encarecidamente realizar la reacción antes de la ejecución de la electroforesis, ya que hay monómeros de acrilamida libres en el gel capaces de modificar los residuos de cisteína de forma irreversible. [18] [19] [20] [21] Los aductos de acrilamida resultantes tienen un peso molecular de 174,05 Da .
Posteriormente se realiza el paso homónimo del método, la digestión en gel de las proteínas. Mediante este procedimiento, la proteína se corta enzimáticamente en un número limitado de fragmentos más cortos. Estos fragmentos se denominan péptidos y permiten la identificación de la proteína con su masa y patrón característicos. La serina proteasa tripsina es la enzima más común utilizada en el análisis de proteínas. La tripsina corta el enlace peptídico específicamente en el extremo carboxilo de los aminoácidos básicos arginina y lisina . Si hay un aminoácido ácido como el ácido aspártico o el ácido glutámico en la vecindad directa del sitio de corte, la tasa de hidrólisis disminuye, una prolina C-terminal en el sitio de corte inhibe la hidrólisis por completo. [22]
Un efecto secundario indeseable del uso de enzimas proteolíticas es la autodigestión de la proteasa. Para evitar esto, en el pasado se añadían iones Ca 2+ al tampón de digestión. [23] [24] Hoy en día, la mayoría de los proveedores ofrecen tripsina modificada donde la metilación selectiva de las lisinas limita la actividad autolítica a los sitios de corte de arginina. [25] La tripsina sin modificar tiene su actividad más alta entre 35 °C y 45 °C. Después de la modificación, la temperatura óptima se cambia al rango de 50 °C a 55 °C. [16] [26] Otras enzimas utilizadas para la digestión en gel son las endo proteasas Lys-C, [27] [28] [29] Glu-C, [30] [31] [32] Asp-N [33] y Lys-N . [34] [35] Estas proteasas cortan específicamente en un solo aminoácido, por ejemplo, Asp-N corta el extremo n del ácido aspártico. [27] Por lo tanto, se obtiene un menor número de péptidos más largos.
El análisis de la secuencia primaria completa de una proteína utilizando una sola proteasa no suele ser posible. En esos casos se recomienda la digestión de la proteína diana en varios enfoques con diferentes enzimas. Los péptidos superpuestos resultantes permiten el ensamblaje de la secuencia completa de la proteína. [30] [36] [37]
Para la digestión, las proteínas fijadas en la matriz del gel deben hacerse accesibles a la proteasa. Se cree que la permeación de la enzima al gel se facilita mediante la deshidratación de los trozos de gel mediante el tratamiento con acetonitrilo y el posterior hinchamiento en el tampón de digestión que contiene la proteasa. Este procedimiento se basa en la presunción de que la proteasa permea al gel mediante el proceso de hinchamiento. [2] Diferentes estudios sobre la penetración de las enzimas al gel mostraron que el proceso está impulsado casi completamente por la difusión. El secado del gel no parece apoyar el proceso. [7] [16] Por lo tanto, la mejora de la digestión en gel debe lograrse mediante la reducción de la ruta de la enzima a su sustrato, por ejemplo cortando el gel en trozos lo más pequeños posible.
Por lo general, la digestión en gel se realiza durante la noche. Para el uso de tripsina como proteasa y una temperatura de 37 °C, el tiempo de incubación que se encuentra en la mayoría de los protocolos es de 12 a 15 h. Sin embargo, los experimentos sobre la duración del proceso de digestión mostraron que después de 3 h hay suficiente material para un análisis espectrométrico de masas exitoso. [38] Además, la optimización de las condiciones para la proteasa en temperatura y pH permite completar la digestión de una muestra en 30 min. [16]
Los surfactantes (detergentes) pueden ayudar a la solubilización y desnaturalización de las proteínas en el gel y, por lo tanto, acortar los tiempos de digestión y aumentar la escisión de las proteínas y la cantidad y el número de péptidos extraídos, especialmente en el caso de las proteínas lipofílicas , como las proteínas de membrana . Los detergentes escindibles son detergentes que se escinden después de la digestión, a menudo en condiciones ácidas. Esto hace que la adición de detergentes sea compatible con la espectrometría de masas.
Después de terminar la digestión, los péptidos generados en este proceso deben extraerse de la matriz de gel. Esto se logra mediante uno o varios pasos de extracción . Las partículas de gel se incuban con una solución de extracción y se recolecta el sobrenadante. En la primera extracción, se recupera casi todo el péptido, la repetición del paso de extracción puede aumentar el rendimiento de todo el proceso en solo un 5-10%. [10] Para cumplir con los requisitos de péptidos con diferentes propiedades físicas y químicas, se realiza una extracción iterativa con soluciones básicas o ácidas. Para la extracción de péptidos ácidos, se utiliza una solución similar a la concentración y composición del tampón de digestión; los péptidos básicos se extraen en dependencia del método espectrométrico de masas previsto con una solución ácida de baja concentración de ácido fórmico para ESI y ácido trifluoroacético para MALDI respectivamente. Los estudios sobre proteínas modelo mostraron una recuperación de aproximadamente el 70-80% del rendimiento de péptido esperado por extracción del gel. [10] Muchos protocolos contienen una fracción adicional de acetonitrilo a la solución de extracción que, en concentraciones superiores al 30% (v/v), es eficaz para reducir la adsorción de péptidos a la superficie de los tubos de reacción y las puntas de las pipetas . [39] El líquido de los extractos agrupados se evapora en un evaporador centrífugo . Si se utilizó la sal volátil bicarbonato de amonio para la extracción básica, se elimina parcialmente en el proceso de secado. Los péptidos secos se pueden almacenar a -20 °C durante al menos seis meses.
Algunas de las principales desventajas de los protocolos comunes para la digestión en gel son el tiempo prolongado necesario y los múltiples pasos de procesamiento, lo que hace que el método sea propenso a errores con respecto a las contaminaciones (especialmente la queratina ). Estas desventajas se eliminaron en gran medida mediante el desarrollo de protocolos optimizados y tubos de reacción especializados. [7]
Más graves que las dificultades con el manejo son las pérdidas de material durante el procesamiento de las muestras. El análisis de proteínas mediante espectrometría de masas a menudo se realiza en el límite de detección, por lo que incluso pequeñas pérdidas pueden determinar el éxito o el fracaso de todo el análisis. Estas pérdidas se deben al lavado durante los diferentes pasos del procesamiento, la adsorción a la superficie de los tubos de reacción y las puntas de las pipetas , la extracción incompleta de péptidos del gel y/o la mala ionización de péptidos individuales en el espectrómetro de masas . [10] [40] Dependiendo de las propiedades fisicoquímicas de los péptidos, las pérdidas pueden variar entre el 15 y el 50%. Debido a la heterogeneidad inherente de los péptidos, hasta ahora, no se ha encontrado una solución universalmente válida para este importante inconveniente del método.
Las implementaciones comerciales de la digestión en gel deben dividirse en productos para laboratorios de alto y bajo rendimiento.
Debido a que el procedimiento estándar requiere mucho tiempo y trabajo, el método de digestión en gel se limitaba a procesar una cantidad relativamente pequeña de puntos de proteína a la vez. Por lo tanto, se ha descubierto que es el objeto ideal para las ambiciones de automatización para superar estas limitaciones en los laboratorios industriales y de servicios. [41] Hoy en día, en los laboratorios donde se realiza la digestión en gel en cantidades de alto rendimiento, el procedimiento suele estar automatizado. El grado de automatización varía desde simples robots de pipeteo hasta soluciones todo en uno altamente sofisticadas, que ofrecen un flujo de trabajo automatizado desde el gel hasta la espectrometría de masas. Los sistemas suelen constar de un selector de puntos, un robot de digestión y un detector.
Las ventajas de la automatización, además de la mayor cantidad de puntos que se deben procesar a la vez, son la reducción del trabajo manual y la mejora de la estandarización . Debido a los numerosos pasos de manipulación del método, los resultados del proceso manual pueden variar según la destreza del usuario y el riesgo de contaminación es alto. Por lo tanto, la calidad de los resultados se describe como una de las principales ventajas del proceso automatizado. [42]
Las desventajas de las soluciones automatizadas son los costos de los robots, el mantenimiento y los consumibles, así como la complicada configuración del proceso. Dado que la selección automatizada necesita información digitalizada de la ubicación del punto, el análisis de la imagen del gel para los puntos relevantes debe realizarse mediante un software que requiere métodos de obtención de imágenes estandarizados y escáneres especiales. Este largo procedimiento impide que el investigador identifique espontáneamente algunos puntos interesantes de un solo gel, así como la necesidad de operar los sistemas a plena capacidad. La cantidad resultante de datos del posterior análisis automatizado de MS es otro problema de los sistemas de alto rendimiento, ya que su calidad es a menudo cuestionable y la evaluación de estos datos lleva mucho más tiempo que la recopilación. [43] [44]
Los inconvenientes mencionados limitan el uso razonable de los sistemas automatizados de digestión en gel al laboratorio de rutina, mientras que el laboratorio de investigación que exige un uso flexible de los instrumentos de identificación de proteínas suele optar por métodos manuales de bajo rendimiento para la digestión en gel y el análisis MS. Este grupo de clientes es el objetivo de la industria con varios sistemas de kit para la digestión en gel.
La mayoría de los sistemas de kits son meros conjuntos de sustancias químicas y enzimas necesarias para la digestión en gel, mientras que el protocolo subyacente permanece inalterado con respecto al procedimiento manual estándar descrito anteriormente. La ventaja de estos productos para el cliente inexperto radica en el funcionamiento garantizado de las diversas soluciones en combinación con un protocolo listo para usar para el proceso.
Algunas empresas han intentado mejorar el proceso de manipulación de la digestión en gel para permitir un flujo de trabajo más sencillo y estandarizado, incluso con la preparación manual de las muestras. El kit Montage In-Gel Digest de Millipore se basa en el protocolo estándar, pero permite procesar una gran cantidad de muestras paralelas al transferir la manipulación de los trozos de gel a una microplaca de 96 pocillos modificada. Las soluciones para los diversos pasos de la digestión en gel se pipetean en los pocillos de esta placa, mientras que la eliminación de líquidos se realiza a través del fondo de los pocillos mediante una bomba de vacío . Este sistema simplifica la manipulación de los múltiples pasos de pipeteo mediante el uso de pipetas multicanal e incluso robots de pipeteo. De hecho, algunos fabricantes de sistemas de alto rendimiento han adoptado el sistema para trabajar con sus robots. Esto ilustra la orientación de esta solución de kit a los laboratorios con una mayor cantidad de muestras.