El bromuro de etidio (o bromuro de homidium , [2] sal de cloruro de homidium cloruro ) [3] [4] es un agente intercalante que se utiliza comúnmente como etiqueta fluorescente ( tinción de ácido nucleico ) en laboratorios de biología molecular para técnicas como la electroforesis en gel de agarosa . Se abrevia comúnmente como EtBr , que también es una abreviatura de bromoetano . Para evitar confusiones, algunos laboratorios han utilizado la abreviatura EthBr para esta sal. Cuando se expone a la luz ultravioleta , fluorescerá con un color naranja, que se intensifica casi 20 veces después de unirse al ADN . Bajo el nombre de homidium , se ha utilizado comúnmente desde la década de 1950 en medicina veterinaria para tratar la tripanosomiasis en el ganado. [5] La alta incidencia de resistencia a los antimicrobianos hace que este tratamiento sea poco práctico en algunas áreas, donde se utiliza en su lugar el cloruro de isometamidium relacionado . A pesar de su reputación como mutágeno, las pruebas han demostrado que tiene baja mutagenicidad sin activación metabólica. [6] [7]
Como ocurre con la mayoría de los compuestos fluorescentes , el bromuro de etidio es aromático . Su fracción heterocíclica central se conoce genéricamente como fenantridina , un isómero del cual es el colorante fluorescente acridina . Los máximos de absorción de EtBr en solución acuosa están a 210 nm y 285 nm, que corresponden a la luz ultravioleta . Como resultado de esta excitación , EtBr emite una luz anaranjada con una longitud de onda de 605 nm. [8] [9]
La intensa fluorescencia del bromuro de etidio después de unirse al ADN probablemente no se deba a una estabilización rígida de la fracción fenilo , porque se ha demostrado que el anillo fenilo se proyecta fuera de las bases intercaladas. De hecho, se ha descubierto que el grupo fenilo es casi perpendicular al plano del sistema de anillos, ya que gira alrededor de su enlace simple para encontrar una posición en la que incida mínimamente sobre el sistema de anillos. En cambio, se cree que el responsable es el entorno hidrofóbico que se encuentra entre los pares de bases . Al moverse hacia este entorno hidrofóbico y alejarse del disolvente, el catión etidio se ve obligado a desprenderse de cualquier molécula de agua que estuviera asociada con él. Como el agua es un inhibidor de la fluorescencia muy eficaz , la eliminación de estas moléculas de agua permite que el etidio emita fluorescencia. [ cita requerida ]
El bromuro de etidio se utiliza habitualmente para detectar ácidos nucleicos en los laboratorios de biología molecular. En el caso del ADN, suele ser ADN bicatenario procedente de PCR , digestos de restricción , etc. También se puede detectar ARN monocatenario , ya que normalmente se pliega sobre sí mismo y proporciona así un apareamiento de bases local para que el colorante se intercale. La detección normalmente implica un gel que contiene ácidos nucleicos colocado sobre o debajo de una lámpara ultravioleta. Dado que la luz ultravioleta es perjudicial para los ojos y la piel, los geles teñidos con bromuro de etidio suelen visualizarse indirectamente utilizando una cámara cerrada, y las imágenes fluorescentes se registran como fotografías. Cuando se necesita una visualización directa, se deben proteger los ojos y la piel expuesta del observador. En el laboratorio, las propiedades de intercalación se han utilizado durante mucho tiempo para minimizar la condensación cromosómica cuando un cultivo se expone a agentes que detienen la mitosis durante la cosecha. Las preparaciones de portaobjetos resultantes permiten un mayor grado de resolución y, por tanto, más confianza a la hora de determinar la integridad estructural de los cromosomas tras el análisis microscópico. [ cita requerida ]
El bromuro de etidio también se utiliza durante la separación de fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa . [10] Se añade al tampón de ejecución y se une intercalándose entre pares de bases de ADN. Cuando el gel de agarosa se ilumina con luz ultravioleta, las bandas de ADN se vuelven visibles. La intercalación de EtBr puede alterar las propiedades de la molécula de ADN, como la carga, el peso, la conformación y la flexibilidad. Dado que las movilidades de las moléculas de ADN a través del gel de agarosa se miden en relación con un estándar de peso molecular, los efectos del EtBr pueden ser críticos para determinar los tamaños de las moléculas. [11]
El bromuro de etidio también se ha utilizado ampliamente para reducir el número de copias de ADN mitocondrial en células en proliferación. [12] El efecto del EtBr sobre el ADN mitocondrial se utiliza en medicina veterinaria para tratar la tripanosomiasis en el ganado, ya que el EtBr se une a las moléculas de ADN de los cinetoplastos y cambia su conformación a la forma Z-ADN . Esta forma inhibe la replicación del ADN de los cinetoplastos, que es letal para los tripanosomas. [13]
La sal de cloruro de homidio tiene las mismas aplicaciones. [3] [4]
El bromuro de etidio se puede agregar al medio YPD y usarse como inhibidor del crecimiento celular. [14]
La afinidad de unión de las nanopartículas catiónicas con el ADN podría evaluarse mediante la unión competitiva con bromuro de etidio. [15] [16]
Existen alternativas al bromuro de etidio que se anuncian como menos peligrosas y con un mejor rendimiento. [17] [18] Por ejemplo, algunos investigadores utilizan varios tintes basados en SYBR y hay otros tintes emergentes como "Novel Juice". Los tintes SYBR son menos mutagénicos que EtBr según la prueba de Ames con extracto de hígado. [19] Sin embargo, se descubrió que SYBR Green I era más mutagénico que EtBr para las células bacterianas expuestas a UV (que se utiliza para visualizar cualquiera de los tintes). [20] Este puede ser el caso de otros tintes "más seguros", pero si bien hay detalles mutagénicos y de toxicidad disponibles [21], estos no se han publicado en revistas revisadas por pares. La MSDS de SYBR Safe informa una LD 50 para ratas de más de 5 g/kg, que es más alta que la de EtBr (1,5 g/kg). Muchos tintes alternativos están suspendidos en DMSO , lo que tiene sus propias implicaciones para la salud, incluida una mayor absorción cutánea de compuestos orgánicos. [19] A pesar de la ventaja de rendimiento que supone utilizar colorantes SYBR en lugar de EtBr para fines de tinción, muchos investigadores aún prefieren EtBr ya que es considerablemente menos costoso. [ cita requerida ]
La mayor parte del uso de bromuro de etidio en el laboratorio (0,25–1 μg/mL) es inferior a la dosis LD50, lo que hace improbable la toxicidad aguda. Se necesitarían pruebas en seres humanos y estudios más prolongados en un sistema de mamíferos para comprender plenamente el riesgo a largo plazo que el bromuro de etidio supone para los trabajadores de laboratorio, pero está claro que el bromuro de etidio puede causar mutaciones en células de mamíferos y bacterias. [22]
El bromuro de etidio no está regulado como residuo peligroso en concentraciones bajas, [23] pero muchas organizaciones lo tratan como tal. El material debe manipularse de acuerdo con la hoja de datos de seguridad (HDS) del fabricante. [ cita requerida ]
La eliminación del bromuro de etidio en laboratorios sigue siendo un tema controvertido. [24] El bromuro de etidio se puede degradar químicamente o recolectar e incinerar. Es común que los desechos de bromuro de etidio por debajo de una concentración obligatoria se eliminen de manera normal (por ejemplo, vertiéndolos por un desagüe). Una práctica común es tratar el bromuro de etidio con hipoclorito de sodio (lejía) antes de su eliminación. [25] Según Lunn y Sansone, la degradación química con lejía produce compuestos que son mutagénicos según la prueba de Ames . Faltan datos sobre los efectos mutagénicos de los productos de degradación. Lunn y Sansone describen métodos más efectivos para la degradación. [26] En otros lugares, se recomienda la eliminación del bromuro de etidio de las soluciones con carbón activado o resina de intercambio iónico . [27] Hay varios productos comerciales disponibles para este uso. [28]
Los tripanosomas en el valle del río Gibe en el suroeste de Etiopía mostraron resistencia universal entre julio de 1989 y febrero de 1993. [29] Esto probablemente indica una pérdida permanente de función en esta área contra el objetivo probado, T. congolense aislado del ganado Boran . [29]
Medios relacionados con el bromuro de etidio en Wikimedia Commons