La prueba de Ames es un método ampliamente utilizado que utiliza bacterias para comprobar si una determinada sustancia química puede provocar mutaciones en el ADN del organismo de prueba. Más formalmente, es un ensayo biológico para evaluar el potencial mutagénico de compuestos químicos. [1] Una prueba positiva indica que la sustancia química es mutagénica y, por lo tanto, puede actuar como carcinógeno , porque el cáncer a menudo está relacionado con una mutación . La prueba sirve como un ensayo rápido y conveniente para estimar el potencial carcinógeno de un compuesto porque los ensayos carcinógenos estándar en ratones y ratas requieren mucho tiempo (tardan de dos a tres años en completarse) y son costosos. Sin embargo, se conocen falsos positivos y falsos negativos. [2]
El procedimiento fue descrito en una serie de artículos a principios de la década de 1970 por Bruce Ames y su grupo de la Universidad de California, Berkeley . [3] [4] [5] [6]
La prueba de Ames utiliza varias cepas de la bacteria Salmonella typhimurium que portan mutaciones en genes implicados en la síntesis de histidina . Estas cepas son mutantes auxótrofos , es decir, necesitan histidina para crecer, pero no pueden producirla. El método prueba la capacidad de la sustancia probada para crear mutaciones que den como resultado un retorno a un estado "prototrófico", de modo que las células puedan crecer en un medio libre de histidina.
Las cepas de prueba están especialmente construidas para detectar mutaciones de cambio de marco (por ejemplo, cepas TA-1537 y TA-1538) o puntuales (por ejemplo, cepa TA-1531) en los genes necesarios para sintetizar histidina, de modo que se puedan identificar mutágenos que actúan a través de diferentes mecanismos. Algunos compuestos son bastante específicos y provocan reversiones en sólo una o dos cepas. [4] Las cepas de prueba también portan mutaciones en los genes responsables de la síntesis de lipopolisacáridos , lo que hace que la pared celular de las bacterias sea más permeable, [5] y en el sistema de reparación por escisión para hacer que la prueba sea más sensible. [6]
Los organismos más grandes, como los mamíferos, tienen procesos metabólicos que potencialmente podrían convertir una sustancia química considerada no mutagénica en una que sí lo es o una que se considera mutagénica en una que no lo es. [7] Por lo tanto, para probar más eficazmente la mutagenicidad de un compuesto químico en relación con organismos más grandes, se pueden agregar enzimas de hígado de rata en un intento de replicar el efecto de los procesos metabólicos en el compuesto que se está probando en la prueba de Ames. Opcionalmente se agrega extracto de hígado de rata para simular el efecto del metabolismo , ya que algunos compuestos, como el benzo[ a ]pireno , no son mutagénicos en sí mismos, pero sus productos metabólicos sí lo son. [3]
Las bacterias se esparcen en una placa de agar con una pequeña cantidad de histidina. Esta pequeña cantidad de histidina en el medio de crecimiento permite que las bacterias crezcan por un tiempo inicial y tengan la oportunidad de mutar. Cuando la histidina se agota, sólo sobrevivirán las bacterias que hayan mutado para ganar la capacidad de producir su propia histidina. La placa se incuba durante 48 horas. La mutagenicidad de una sustancia es proporcional al número de colonias observadas.
Los mutágenos identificados mediante la prueba de Ames también son posibles carcinógenos, y los primeros estudios de Ames demostraron que el 90% de los carcinógenos conocidos pueden identificarse mediante esta prueba. [8] Sin embargo, estudios posteriores mostraron la identificación de entre el 50% y el 70% de los carcinógenos conocidos. [ cita necesaria ] La prueba se utilizó para identificar una serie de compuestos utilizados anteriormente en productos comerciales como posibles carcinógenos. [9] Los ejemplos incluyen tris(2,3-dibromopropil)fosfato , que se usó como retardante de llama en plástico y textiles como ropa de dormir para niños, [10] y furilfuramida que se usó como aditivo antibacteriano en los alimentos en Japón en la década de 1960. y 1970. De hecho, la furilfuramida había pasado previamente pruebas en animales, pero pruebas más rigurosas después de su identificación en la prueba de Ames demostraron que era cancerígena. [11] Sus pruebas positivas dieron como resultado que esos químicos fueran retirados del uso en productos de consumo.
Un resultado interesante de la prueba de Ames es que la curva dosis-respuesta que utiliza concentraciones variables de la sustancia química es casi siempre lineal, [8] lo que indica que no existe una concentración umbral para la mutagénesis. Por lo tanto, sugiere que, como ocurre con la radiación, puede que no exista un umbral seguro para los mutágenos o carcinógenos químicos. [12] [13] Sin embargo, algunos han propuesto que los organismos podrían tolerar niveles bajos de mutágenos debido a mecanismos protectores como la reparación del ADN y, por lo tanto, puede existir un umbral para ciertos mutágenos químicos. [14] El propio Bruce Ames argumentó en contra de la extrapolación lineal dosis-respuesta de la dosis alta utilizada en pruebas de carcinogénesis en sistemas animales a la dosis más baja de sustancias químicas que normalmente se encuentran en la exposición humana, ya que los resultados pueden ser falsos positivos debido a la respuesta mitogénica causada por la dosis artificialmente altas de sustancias químicas utilizadas en dichas pruebas. [15] [16] También advirtió contra la "histeria por pequeños rastros de sustancias químicas que pueden o no causar cáncer", que "elimina por completo los principales riesgos que debes tener en cuenta". [17]
La prueba de Ames se utiliza a menudo como una de las pruebas iniciales de posibles medicamentos para eliminar posibles carcinógenos, y es una de las ocho pruebas requeridas por la Ley de Pesticidas (EE. UU.) y una de las seis pruebas requeridas por la Ley de Control de Sustancias Tóxicas. (EE.UU). [18]
Salmonella typhimurium es procariota, por lo que no es un modelo perfecto para los humanos. La fracción S9 de hígado de rata se utiliza para imitar las condiciones metabólicas de los mamíferos de modo que pueda evaluarse el potencial mutagénico de los metabolitos formados por una molécula original en el sistema hepático; sin embargo, existen diferencias en el metabolismo entre humanos y ratas que pueden afectar la mutagenicidad de las sustancias químicas que se prueban. [19] Por lo tanto, la prueba puede mejorarse mediante el uso de la fracción S9 de hígado humano; Anteriormente su uso estaba limitado por su disponibilidad, pero ahora está disponible comercialmente y, por lo tanto, puede ser más factible. [20] Se ha creado un modelo in vitro adaptado para células eucariotas, por ejemplo, levaduras.
Los mutágenos identificados en la prueba de Ames no tienen por qué ser necesariamente cancerígenos, y se requieren pruebas adicionales para cualquier carcinógeno potencial identificado en la prueba. Los medicamentos que contienen la fracción nitrato a veces dan resultados positivos para Ames cuando en realidad son seguros. Los compuestos de nitrato pueden generar óxido nítrico , una importante molécula señal que puede dar un falso positivo. La nitroglicerina es un ejemplo que da un Ames positivo pero todavía se usa en el tratamiento en la actualidad. Sin embargo, los nitratos en los alimentos pueden reducirse por acción bacteriana a nitritos, que se sabe que generan carcinógenos al reaccionar con aminas y amidas. Se necesitan largos estudios toxicológicos y de resultados con dichos compuestos para refutar una prueba de Ames positiva.
La prueba de Ames se desarrolló inicialmente utilizando placas de agar (la técnica de incorporación en placa), como se describió anteriormente. Desde entonces se ha desarrollado una alternativa a la realización del test de Ames, conocida como "método de fluctuación". Esta técnica es igual en concepto que el método basado en agar, en el que se añaden bacterias a una mezcla de reacción con una pequeña cantidad de histidina , lo que permite que las bacterias crezcan y muten, volviendo a sintetizar su propia histidina. Al incluir un indicador de pH, la frecuencia de mutación se cuenta en las microplacas como el número de pocillos que han cambiado de color (provocado por una caída del pH debido a procesos metabólicos de las bacterias que se reproducen). Al igual que con la prueba de Ames tradicional, la muestra se compara con la tasa de fondo natural de mutación inversa para establecer la genotoxicidad de una sustancia. El método de fluctuación se realiza íntegramente en cultivo líquido y se puntúa contando el número de pocillos que pasan de amarillo a morado en microplacas de 96 o 384 pocillos.
En el método de placa de 96 pocillos, la frecuencia de mutación se cuenta como el número de pocillos de 96 que han cambiado de color. Las placas se incuban durante un máximo de cinco días, contando las colonias mutadas (amarillas) cada día y comparándolas con la tasa de fondo de mutación inversa utilizando tablas de significación establecidas para determinar las diferencias significativas entre la tasa de mutación de fondo y la de los sujetos sometidos a prueba. muestras.
En el método de microfluctuación en placa de 384 pocillos, más reducido, la frecuencia de mutación se cuenta como el número de pocillos de 48 que han cambiado de color después de 2 días de incubación. Se analiza una muestra de prueba en 6 niveles de dosis con dosis cero (de fondo) y controles positivos simultáneos, todos los cuales caben en una placa de 384 pocillos. El ensayo se realiza por triplicado para proporcionar solidez estadística. Utiliza las cepas de prueba recomendadas por la Directiva 471 de la OCDE (auxotrofos de histidina y auxótrofos de triptófano).
El método de fluctuación es comparable al método tradicional de vertido en placa en términos de sensibilidad y precisión; sin embargo, tiene una serie de ventajas: necesita menos muestra de prueba, tiene un criterio de valoración colorimétrico simple y cuenta el número de pocillos positivos fuera de lo posible. 96 ó 48 pocillos requiere mucho menos tiempo que contar colonias individuales en una placa de agar. Hay varios kits comerciales disponibles. La mayoría de los kits tienen componentes consumibles listos para usar, incluidas bacterias liofilizadas, y las pruebas se pueden realizar utilizando pipetas multicanal. El método de fluctuación también permite probar volúmenes más altos de muestras acuosas (hasta 75% v/v), aumentando la sensibilidad y extendiendo su aplicación a mutágenos ambientales de bajo nivel. [21]