La PCR dependiente de la ARNasa H (rhPCR) [1] es una modificación de la técnica estándar de PCR . En la rhPCR, los cebadores están diseñados con un bloque de amplificación extraíble en el extremo 3'. La amplificación del cebador bloqueado depende de la actividad de escisión de una enzima ARNasa H de tipo II arqueal hipertermófila durante la hibridación con la secuencia diana complementaria. Esta enzima ARNasa H posee varias características útiles que mejoran la PCR. En primer lugar, tiene muy poca actividad enzimática a baja temperatura, lo que permite una " PCR de inicio en caliente " sin modificaciones en la ADN polimerasa . En segundo lugar, la eficiencia de escisión de la enzima se reduce en presencia de desajustes cerca del residuo de ARN. Esto permite una formación reducida de dímeros de cebadores , [1] la detección de variantes de empalme alternativo , [2] [3] la capacidad de realizar PCR multiplex con un mayor número de cebadores de PCR y la capacidad de detectar polimorfismos de un solo nucleótido . [4]
Los cebadores de PCR humana recombinante (rhPCR) constan de tres secciones. 1) La sección de ADN 5', equivalente en longitud y requisitos de temperatura de fusión (Tm) a un cebador de PCR estándar, se extiende después de la escisión por la enzima ARNasa HII. 2) Una única base de ARN proporciona el sitio de escisión para la ARNasa HII. 3) Una extensión corta de 3' de cuatro o cinco bases seguida de un bloqueador (normalmente una molécula corta, no extensible como un propanodiol ) impide la extensión por una ADN polimerasa hasta su eliminación. Una reacción de PCR humana recombinante (rhPCR) comienza con los cebadores y la plantilla libres en solución (Figura 1). Mientras están libres en solución, estos cebadores no son desbloqueados por la enzima ARNasa HII, ya que deben estar en un heterodúplex ARN:ADN con la plantilla que se va a escindir. Una vez unidos a la plantilla, los cebadores de PCR humana recombinante (rhPCR) son escindidos por la enzima ARNasa HII termoestable. Esto elimina el bloqueo, lo que permite que la ADN polimerasa se extienda más allá de los cebadores. El ciclo de la reacción de PCR continúa el proceso. Los cebadores de rhPCR están diseñados de modo que después de la escisión por la enzima ARNasa H2, la Tm de los cebadores sea aún mayor que la temperatura de hibridación de la reacción de PCR. Estos cebadores se pueden utilizar tanto en los tipos de PCR cuantitativa Taqman de 5' como de SYBR Green .
La rhPCR se puede utilizar para PCR cuantitativa y en laboratorios médicos o ambientales: