La digestión por restricción es un procedimiento que se utiliza en biología molecular para preparar el ADN para su análisis u otro procesamiento. A veces se denomina fragmentación del ADN , aunque este término también se utiliza para otros procedimientos. En una digestión por restricción, las moléculas de ADN se escinden en sitios de restricción específicos de 4 a 12 nucleótidos de longitud mediante el uso de enzimas de restricción que reconocen estas secuencias. [1]
El ADN digerido resultante suele amplificarse selectivamente mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), lo que lo hace más adecuado para técnicas analíticas como la electroforesis en gel de agarosa y la cromatografía . Se utiliza en la identificación genética , la subclonación de plásmidos y el análisis RFLP .
Una enzima de restricción determinada corta segmentos de ADN dentro de una secuencia de nucleótidos específica , en lo que se denomina un sitio de restricción . Estas secuencias de reconocimiento suelen tener cuatro, seis, ocho, diez o doce nucleótidos de longitud y, por lo general, son palindrómicas (es decir, la misma secuencia de nucleótidos en la dirección 5' - 3'). Debido a que solo hay un número limitado de formas de organizar los cuatro nucleótidos que componen el ADN (adenina, timina, guanina y citosina) en una secuencia de cuatro a doce nucleótidos, las secuencias de reconocimiento tienden a aparecer por casualidad en cualquier secuencia larga. Se han identificado y sintetizado enzimas de restricción específicas para cientos de secuencias distintas para su venta a laboratorios y, como resultado, aparecen varios "sitios de restricción" potenciales en casi cualquier gen o locus de interés en cualquier cromosoma. Además, casi todos los plásmidos artificiales incluyen un polienlazador (a menudo totalmente sintético) (también llamado "sitio de clonación múltiple") que contiene docenas de secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción dentro de un segmento muy corto de ADN. Esto permite la inserción de casi cualquier fragmento específico de ADN en vectores plasmídicos , que pueden "clonarse" eficientemente mediante su inserción en células bacterianas en replicación.
Después de la digestión por restricción, el ADN puede analizarse mediante electroforesis en gel de agarosa . En la electroforesis en gel, primero se "carga" una muestra de ADN en una placa de gel de agarosa (literalmente, se pipetea en pequeños pocillos en un extremo de la placa). Luego, el gel se somete a un campo eléctrico, que atrae el ADN cargado negativamente a través de él. Las moléculas viajan a diferentes velocidades (y, por lo tanto, terminan a diferentes distancias) dependiendo de su carga neta (las partículas con mayor carga viajan más lejos) y su tamaño (las partículas más pequeñas viajan más lejos). Dado que ninguna de las cuatro bases de nucleótidos tiene carga, la carga neta se vuelve insignificante y el tamaño es el factor principal que afecta la velocidad de difusión a través del gel. La carga neta en el ADN es producida por la cadena principal de azúcar-fosfato . Esto es en contraste con las proteínas, en las que no hay "cadena principal", y la carga neta es generada por diferentes combinaciones y cantidades de aminoácidos cargados .
La digestión por restricción se utiliza con mayor frecuencia como parte del proceso de clonación molecular de un fragmento de ADN en un vector (como un vector de clonación o un vector de expresión ). El vector normalmente contiene un sitio de clonación múltiple donde se pueden encontrar muchos sitios de restricción, y se puede insertar un fragmento extraño de ADN en el vector cortando primero los sitios de restricción en el vector y el fragmento de ADN, seguido de la ligadura del fragmento de ADN en el vector.
Los resúmenes de restricción también son necesarios para realizar cualquiera de las siguientes técnicas analíticas:
Existen numerosos tipos de enzimas de restricción, cada una de las cuales corta el ADN de forma diferente. Las enzimas de restricción más utilizadas son las endonucleasas de restricción de tipo II (consulte el artículo sobre enzimas de restricción para ver ejemplos). Hay algunas que cortan una secuencia de tres pares de bases, mientras que otras pueden cortar cuatro, seis e incluso ocho. Cada enzima tiene propiedades distintas que determinan la eficiencia con la que puede cortar y en qué condiciones. La mayoría de los fabricantes que producen dichas enzimas suelen proporcionar una solución tampón específica que contiene la mezcla única de cationes y otros componentes que ayudan a la enzima a cortar de la forma más eficiente posible. Las diferentes enzimas de restricción también pueden tener diferentes temperaturas óptimas a las que funcionan.
Tenga en cuenta que para una digestión eficiente del ADN, el sitio de restricción no debe estar ubicado en el extremo final de un fragmento de ADN. Las enzimas de restricción pueden requerir una cantidad mínima de pares de bases entre el sitio de restricción y el extremo del ADN para que la enzima funcione de manera eficiente. [2] Esta cantidad puede variar entre enzimas, pero para las enzimas de restricción más utilizadas, alrededor de 6 a 10 pares de bases es suficiente.