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Cultivo celular

Cultivo de células en una pequeña placa de Petri
Células epiteliales en cultivo, teñidas para queratina (rojo) y ADN (verde)

El cultivo celular o cultivo de tejidos es el proceso mediante el cual las células se cultivan en condiciones controladas, generalmente fuera de su entorno natural. Una vez que las células de interés se han aislado del tejido vivo , se pueden mantener posteriormente en condiciones cuidadosamente controladas. Deben mantenerse a temperatura corporal (37 °C) en una incubadora. [1] Estas condiciones varían para cada tipo de célula, pero generalmente consisten en un recipiente adecuado con un sustrato o medio rico que suministra los nutrientes esenciales ( aminoácidos , carbohidratos , vitaminas , minerales ), factores de crecimiento , hormonas y gases ( CO 2 , O 2 ), y regula el entorno fisicoquímico ( tampón de pH , presión osmótica , temperatura ). La mayoría de las células requieren una superficie o un sustrato artificial para formar un cultivo adherente como una monocapa (una sola célula de espesor), mientras que otras pueden cultivarse flotando libremente en un medio como un cultivo en suspensión . [2] Esto generalmente se facilita mediante el uso de un medio de crecimiento líquido, semisólido o sólido , como caldo o agar . El término cultivo de tejidos se refiere comúnmente al cultivo de células y tejidos animales, y el término más específico de cultivo de tejidos vegetales se utiliza para referirse a las plantas. La vida útil de la mayoría de las células está determinada genéticamente, pero algunas células cultivadas en cultivos celulares se han "transformado" en células inmortales que se reproducirán indefinidamente si se proporcionan las condiciones óptimas.

En la práctica, el término "cultivo celular" se refiere ahora al cultivo de células derivadas de eucariotas multicelulares , especialmente células animales , en contraste con otros tipos de cultivo que también cultivan células, como el cultivo de tejidos vegetales , el cultivo de hongos y el cultivo microbiológico (de microbios ). El desarrollo histórico y los métodos del cultivo celular están estrechamente relacionados con los del cultivo de tejidos y el cultivo de órganos . El cultivo viral también está relacionado, con las células como huéspedes de los virus.

La técnica de laboratorio de mantener líneas celulares vivas (una población de células descendientes de una sola célula y que contienen la misma composición genética) separadas de su fuente de tejido original se volvió más sólida a mediados del siglo XX. [3] [4]

Historia

El fisiólogo inglés del siglo XIX Sydney Ringer desarrolló soluciones salinas que contenían cloruros de sodio, potasio, calcio y magnesio adecuadas para mantener el latido del corazón de un animal aislado fuera del cuerpo. [5] En 1885, Wilhelm Roux extrajo una sección de la placa medular de un pollo embrionario y la mantuvo en una solución salina tibia durante varios días, estableciendo el principio básico del cultivo de tejidos. En 1907, el zoólogo Ross Granville Harrison demostró el crecimiento de células embrionarias de rana que darían lugar a células nerviosas en un medio de linfa coagulada . En 1913, E. Steinhardt, C. Israeli y RA Lambert cultivaron el virus vaccinia en fragmentos de tejido corneal de cobaya . [6] En 1996, el primer uso de tejido regenerativo se utilizó para reemplazar una pequeña longitud de uretra, lo que llevó a la comprensión de que la técnica de obtener muestras de tejido, cultivarlo fuera del cuerpo sin un andamio y volver a aplicarlo, puede usarse solo para pequeñas distancias de menos de 1 cm. [7] [8] [9] Ross Granville Harrison , trabajando en la Escuela de Medicina Johns Hopkins y luego en la Universidad de Yale , publicó los resultados de sus experimentos de 1907 a 1910, estableciendo la metodología del cultivo de tejidos . [10]

Gottlieb Haberlandt fue el primero en señalar las posibilidades del cultivo de tejidos aislados, el cultivo de tejidos vegetales . [11] Sugirió que las potencialidades de las células individuales a través del cultivo de tejidos, así como las influencias recíprocas de los tejidos entre sí, podrían determinarse mediante este método. Desde las afirmaciones originales de Haberlandt, se han realizado métodos para el cultivo de tejidos y células, lo que ha llevado a descubrimientos significativos en biología y medicina. Presentó su idea original de totipotencialidad en 1902, afirmando que "Teóricamente todas las células vegetales son capaces de dar lugar a una planta completa". [12] [13] [14] El término cultivo de tejidos fue acuñado por el patólogo estadounidense Montrose Thomas Burrows . [15]

Las técnicas de cultivo celular avanzaron significativamente en las décadas de 1940 y 1950 para apoyar la investigación en virología . El crecimiento de virus en cultivos celulares permitió la preparación de virus purificados para la fabricación de vacunas . La vacuna inyectable contra la polio desarrollada por Jonas Salk fue uno de los primeros productos producidos en masa utilizando técnicas de cultivo celular. Esta vacuna fue posible gracias a la investigación en cultivo celular de John Franklin Enders , Thomas Huckle Weller y Frederick Chapman Robbins , quienes recibieron un Premio Nobel por su descubrimiento de un método para cultivar el virus en cultivos de células de riñón de mono . El cultivo celular ha contribuido al desarrollo de vacunas para muchas enfermedades. [1]

Uso moderno

Células cultivadas que crecen en un medio de crecimiento.

En el uso moderno, "cultivo de tejidos" se refiere generalmente al crecimiento de células a partir de un tejido de un organismo multicelular in vitro . Estas células pueden ser células aisladas de un organismo donante ( células primarias ) o una línea celular inmortalizada . Las células se bañan en un medio de cultivo, que contiene nutrientes esenciales y fuentes de energía necesarias para la supervivencia de las células. [16] Por lo tanto, en su sentido más amplio, "cultivo de tejidos" a menudo se usa indistintamente con "cultivo celular". Por otro lado, el significado estricto de "cultivo de tejidos" se refiere al cultivo de trozos de tejido, es decir, cultivo de explantos .

El cultivo de tejidos es una herramienta importante para el estudio de la biología de las células de organismos multicelulares. Proporciona un modelo in vitro del tejido en un entorno bien definido que puede manipularse y analizarse fácilmente. En el cultivo de tejidos animales, las células pueden cultivarse como monocapas bidimensionales (cultivo convencional) o dentro de estructuras fibrosas o geles para lograr estructuras tridimensionales más naturales similares a los tejidos (cultivo 3D). Eric Simon, en un informe de subvención del NIH SBIR de 1988, demostró que el electrohilado podía utilizarse para producir estructuras fibrosas poliméricas a escala nanométrica y submicrométrica específicamente diseñadas para su uso como sustratos de células y tejidos in vitro . Este uso temprano de redes fibrosas electrohiladas para el cultivo celular y la ingeniería de tejidos demostró que varios tipos de células se adherirían y proliferarían sobre las fibras de policarbonato. Se observó que, a diferencia de la morfología aplanada que se observa típicamente en el cultivo 2D, las células cultivadas en fibras electrohiladas exhibieron una morfología tridimensional más redondeada que generalmente se observa en los tejidos in vivo . [17]

El cultivo de tejidos vegetales , en particular, se ocupa del crecimiento de plantas enteras a partir de pequeños trozos de tejido vegetal, cultivados en un medio. [18]

Conceptos en el cultivo de células de mamíferos

Aislamiento de células

Las células se pueden aislar de los tejidos para su cultivo ex vivo de varias maneras. Las células se pueden purificar fácilmente de la sangre; sin embargo, solo los glóbulos blancos son capaces de crecer en cultivo. Las células se pueden aislar de tejidos sólidos mediante la digestión de la matriz extracelular utilizando enzimas como la colagenasa , la tripsina o la pronasa , antes de agitar el tejido para liberar las células en suspensión. [19] [20] Alternativamente, se pueden colocar trozos de tejido en medios de crecimiento y las células que crecen están disponibles para el cultivo. Este método se conoce como cultivo de explantos .

Las células que se cultivan directamente de un sujeto se conocen como células primarias. Con excepción de algunas derivadas de tumores, la mayoría de los cultivos de células primarias tienen una vida útil limitada.

Una línea celular establecida o inmortalizada ha adquirido la capacidad de proliferar indefinidamente, ya sea mediante mutación aleatoria o modificación deliberada, como la expresión artificial del gen de la telomerasa . Numerosas líneas celulares están bien establecidas como representativas de tipos celulares particulares .

Mantenimiento de células en cultivo

La mayoría de las células primarias aisladas experimentan un proceso de senescencia y dejan de dividirse después de un cierto número de duplicaciones de su población, aunque generalmente conservan su viabilidad (descrito como el límite de Hayflick ).

Una botella de medio de cultivo celular DMEM

Aparte de la temperatura y la mezcla de gases, el factor más comúnmente variado en los sistemas de cultivo es el medio de crecimiento celular . Las recetas para los medios de crecimiento pueden variar en pH , concentración de glucosa, factores de crecimiento y la presencia de otros nutrientes. Los factores de crecimiento utilizados para complementar los medios a menudo se derivan del suero de sangre animal, como suero bovino fetal (FBS), suero bovino de ternera, suero equino y suero porcino. Una complicación de estos ingredientes derivados de la sangre es el potencial de contaminación del cultivo con virus o priones , particularmente en aplicaciones de biotecnología médica . La práctica actual es minimizar o eliminar el uso de estos ingredientes siempre que sea posible y utilizar lisado de plaquetas humanas (hPL). [21] Esto elimina la preocupación de la contaminación entre especies cuando se usa FBS con células humanas. hPL ha surgido como una alternativa segura y confiable como reemplazo directo de FBS u otro suero animal. Además, se pueden usar medios definidos químicamente para eliminar cualquier rastro de suero (humano o animal), pero esto no siempre se puede lograr con diferentes tipos de células. Las estrategias alternativas incluyen obtener sangre animal de países con un riesgo mínimo de EEB / EET , como Estados Unidos, Australia y Nueva Zelanda, [22] y utilizar concentrados de nutrientes purificados derivados del suero en lugar de suero animal completo para el cultivo celular. [23]

La densidad de siembra (número de células por volumen de medio de cultivo) desempeña un papel fundamental para algunos tipos de células. Por ejemplo, una densidad de siembra más baja hace que las células de la granulosa muestren producción de estrógeno, mientras que una densidad de siembra más alta las hace aparecer como células luteínicas de la teca productoras de progesterona . [24]

Las células se pueden cultivar en suspensión o en cultivos adherentes . [25] Algunas células viven naturalmente en suspensión, sin estar adheridas a una superficie, como las células que existen en el torrente sanguíneo. También hay líneas celulares que se han modificado para poder sobrevivir en cultivos en suspensión para que puedan cultivarse a una densidad mayor que la que permitirían las condiciones adherentes. Las células adherentes requieren una superficie, como un plástico de cultivo de tejidos o un microportador , que puede estar recubierto con componentes de la matriz extracelular (como colágeno y laminina) para aumentar las propiedades de adhesión y proporcionar otras señales necesarias para el crecimiento y la diferenciación. La mayoría de las células derivadas de tejidos sólidos son adherentes. Otro tipo de cultivo adherente es el cultivo organotípico , que implica el crecimiento de células en un entorno tridimensional (3-D) en lugar de placas de cultivo bidimensionales. Este sistema de cultivo 3D es bioquímica y fisiológicamente más similar al tejido in vivo , pero es técnicamente difícil de mantener debido a muchos factores (por ejemplo, la difusión). [26]

Medios basales para cultivo celular

Existen distintos tipos de medios de cultivo celular que se utilizan rutinariamente en las ciencias de la vida, incluidos los siguientes:

Componentes de los medios de cultivo celular

Condiciones típicas de crecimiento

Contaminación cruzada de líneas celulares

La contaminación cruzada de líneas celulares puede ser un problema para los científicos que trabajan con células cultivadas. [27] Los estudios sugieren que entre el 15 y el 20% de las veces, las células utilizadas en experimentos han sido identificadas erróneamente o contaminadas con otra línea celular. [28] [29] [30] Incluso se han detectado problemas con la contaminación cruzada de líneas celulares en líneas del panel NCI-60 , que se utilizan rutinariamente para estudios de detección de fármacos. [31] [32] Los principales repositorios de líneas celulares, incluida la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) y la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ), han recibido presentaciones de líneas celulares de investigadores que fueron identificadas erróneamente por ellos. [31] [33] Dicha contaminación plantea un problema para la calidad de la investigación producida utilizando líneas de cultivo celular, y los principales repositorios ahora están autentificando todas las presentaciones de líneas celulares. [34] La ATCC utiliza la huella de ADN de repetición en tándem corta (STR) para autentificar sus líneas celulares. [35]

Para abordar este problema de contaminación cruzada de líneas celulares, se anima a los investigadores a autenticar sus líneas celulares en un pasaje temprano para establecer la identidad de la línea celular. La autenticación debe repetirse antes de congelar las reservas de líneas celulares, cada dos meses durante el cultivo activo y antes de cualquier publicación de datos de investigación generados utilizando las líneas celulares. Se utilizan muchos métodos para identificar líneas celulares, incluido el análisis de isoenzimas , la tipificación del antígeno linfocítico humano (HLA), el análisis cromosómico, el cariotipo, la morfología y el análisis de STR . [35]

Un importante contaminante cruzado entre líneas celulares es la línea celular inmortal HeLa . La contaminación HeLa se observó por primera vez a principios de los años 60 en un cultivo no humano en los EE. UU. La contaminación intraespecie se descubrió en diecinueve líneas celulares en los años setenta. En 1974, se descubrió que cinco líneas celulares humanas de la Unión Soviética eran HeLa. Un estudio de seguimiento que analizó aproximadamente 50 líneas celulares indicó que la mitad tenía marcadores HeLa, pero el HeLa contaminante se había hibridado con las líneas celulares originales. Se ha informado de contaminación de células HeLa a partir de gotitas de aire . Jonas Salk incluso inyectó HeLa sin que nadie lo supiera en sujetos humanos en un ensayo de vacunas en 1978. [36]

Otros problemas técnicos

Como las células generalmente continúan dividiéndose en un cultivo, generalmente crecen hasta llenar el área o volumen disponible. Esto puede generar varios problemas:

La elección del medio de cultivo puede afectar la relevancia fisiológica de los hallazgos de los experimentos de cultivo celular debido a las diferencias en la composición y las concentraciones de nutrientes. [38] Recientemente se demostró un sesgo sistemático en los conjuntos de datos generados para las pruebas de silenciamiento de genes mediante CRISPR y ARNi , [39] y para el perfil metabólico de líneas celulares cancerosas . [38] El uso de un medio de crecimiento que represente mejor los niveles fisiológicos de nutrientes puede mejorar la relevancia fisiológica de los estudios in vitro y recientemente se desarrollaron tipos de medios como Plasmax [40] y Human Plasma Like Medium (HPLM), [41] .

Manipulación de células cultivadas

Entre las manipulaciones comunes que se llevan a cabo en las células de cultivo se encuentran los cambios de medios, el paso de células y la transfección de células. Estas se realizan generalmente utilizando métodos de cultivo de tejidos que se basan en una técnica aséptica . La técnica aséptica tiene como objetivo evitar la contaminación con bacterias, levaduras u otras líneas celulares. Las manipulaciones se llevan a cabo normalmente en una cabina de bioseguridad o una cabina de flujo laminar para excluir microorganismos contaminantes. También se pueden añadir antibióticos (por ejemplo, penicilina y estreptomicina ) y antimicóticos (por ejemplo, anfotericina B y solución antibiótica-antimicótica ) a los medios de crecimiento.

A medida que las células realizan procesos metabólicos, se produce ácido y el pH disminuye. A menudo, se agrega un indicador de pH al medio para medir el agotamiento de nutrientes.

Cambios en los medios

En el caso de cultivos adherentes, el medio puede eliminarse directamente mediante aspiración y luego reemplazarse. Los cambios de medio en cultivos no adherentes implican centrifugar el cultivo y resuspender las células en medio fresco.

Células que pasan

El paso (también conocido como subcultivo o división de células) implica transferir una pequeña cantidad de células a un nuevo recipiente. Las células se pueden cultivar durante más tiempo si se dividen regularmente, ya que evita la senescencia asociada con la alta densidad celular prolongada. Los cultivos en suspensión se pasan fácilmente con una pequeña cantidad de cultivo que contenga unas pocas células diluidas en un volumen mayor de medio fresco. Para los cultivos adherentes, primero se deben separar las células; esto se hace comúnmente con una mezcla de tripsina - EDTA ; sin embargo, ahora hay otras mezclas de enzimas disponibles para este propósito. Luego, se puede usar una pequeña cantidad de células separadas para sembrar un nuevo cultivo. Algunos cultivos celulares, como las células RAW, se raspan mecánicamente de la superficie de su recipiente con raspadores de goma.

Transfección y transducción

Otro método común para manipular células implica la introducción de ADN extraño mediante transfección . Esto se realiza a menudo para hacer que las células expresen un gen de interés. Más recientemente, la transfección de construcciones de ARNi se ha realizado como un mecanismo conveniente para suprimir la expresión de un gen o proteína en particular. El ADN también se puede insertar en células utilizando virus, en métodos conocidos como transducción , infección o transformación . Los virus, como agentes parásitos, son muy adecuados para introducir ADN en las células, ya que esto es parte de su proceso normal de reproducción.

Líneas celulares humanas establecidas

Las células HeLa cultivadas se han teñido con Hoechst , lo que hace que sus núcleos se vuelvan azules, y son una de las primeras líneas celulares humanas descendientes de Henrietta Lacks , quien murió de cáncer de cuello uterino, del cual se originaron estas células.

Las líneas celulares que se originan en seres humanos han sido algo controvertidas en bioética , ya que pueden sobrevivir a su organismo original y luego ser utilizadas en el descubrimiento de tratamientos médicos lucrativos. En la decisión pionera en esta área, la Corte Suprema de California sostuvo en Moore v. Regents of the University of California que los pacientes humanos no tienen derechos de propiedad sobre las líneas celulares derivadas de órganos extraídos con su consentimiento. [42]

Es posible fusionar células normales con una línea celular inmortalizada . Este método se utiliza para producir anticuerpos monoclonales . En resumen, los linfocitos aislados del bazo (o posiblemente de la sangre) de un animal inmunizado se combinan con una línea celular de mieloma inmortal (linaje de células B) para producir un hibridoma que tiene la especificidad de anticuerpos del linfocito primario y la inmortalidad del mieloma. Se utiliza un medio de crecimiento selectivo (HA o HAT) para seleccionar células de mieloma no fusionadas; los linfocitos primarios mueren rápidamente en cultivo y solo sobreviven las células fusionadas. Estas se examinan para la producción del anticuerpo requerido, generalmente en grupos para comenzar y luego después de la clonación simple.

Cepas celulares

Una cepa celular se deriva de un cultivo primario o de una línea celular mediante la selección o clonación de células que tienen propiedades o características específicas que deben definirse. Las cepas celulares son células que se han adaptado al cultivo pero, a diferencia de las líneas celulares, tienen un potencial de división finito. Las células no inmortalizadas dejan de dividirse después de 40 a 60 duplicaciones de población [43] y, después de esto, pierden su capacidad de proliferar (un evento determinado genéticamente conocido como senescencia). [44]

Aplicaciones del cultivo celular

El cultivo masivo de líneas celulares animales es fundamental para la fabricación de vacunas virales y otros productos de la biotecnología. El cultivo de células madre humanas se utiliza para ampliar el número de células y diferenciarlas en diversos tipos de células somáticas para trasplantes. [45] El cultivo de células madre también se utiliza para recolectar las moléculas y los exosomas que liberan las células madre con fines de desarrollo terapéutico. [46]

Los productos biológicos producidos mediante la tecnología del ADN recombinante (ADNr) en cultivos de células animales incluyen enzimas , hormonas sintéticas , inmunobiológicos ( anticuerpos monoclonales , interleucinas , linfocinas ) y agentes anticancerígenos . Aunque se pueden producir muchas proteínas más simples utilizando ADNr en cultivos bacterianos, actualmente se deben producir proteínas más complejas que están glicosiladas (modificadas con carbohidratos) en células animales. Un ejemplo importante de una proteína tan compleja es la hormona eritropoyetina . El costo de cultivar cultivos de células de mamíferos es alto, por lo que se están realizando investigaciones para producir tales proteínas complejas en células de insectos o en plantas superiores, el uso de células embrionarias individuales y embriones somáticos como fuente para la transferencia directa de genes mediante bombardeo de partículas, expresión de genes de tránsito y observación con microscopía confocal es una de sus aplicaciones. También ofrece confirmar el origen de células individuales de embriones somáticos y la asimetría de la primera división celular, que inicia el proceso.

El cultivo celular es también una técnica clave para la agricultura celular , cuyo objetivo es proporcionar tanto nuevos productos como nuevas formas de producir productos agrícolas existentes como leche, carne (cultivada) , fragancias y cuerno de rinoceronte a partir de células y microorganismos. Por lo tanto, se considera un medio para lograr una agricultura sin animales . También es una herramienta central para la enseñanza de la biología celular. [47]

Cultivo celular en dos dimensiones

La investigación en ingeniería de tejidos , células madre y biología molecular implica principalmente cultivos de células en placas de plástico planas. Esta técnica se conoce como cultivo celular bidimensional (2D) y fue desarrollada por primera vez por Wilhelm Roux , quien, en 1885, extrajo una porción de la placa medular de un pollo embrionario y la mantuvo en solución salina tibia durante varios días en una placa de vidrio plana. A partir del avance de la tecnología de polímeros surgió la placa de plástico estándar actual para el cultivo celular 2D, comúnmente conocida como placa de Petri . A Julius Richard Petri , un bacteriólogo alemán , generalmente se le atribuye esta invención mientras trabajaba como asistente de Robert Koch . Varios investigadores hoy también utilizan matraces de laboratorio de cultivo , cónicos e incluso bolsas desechables como las que se usan en los biorreactores de un solo uso .

Además de las placas de Petri, los científicos llevan mucho tiempo cultivando células en matrices derivadas de fuentes biológicas, como el colágeno o la fibrina, y, más recientemente, en hidrogeles sintéticos, como la poliacrilamida o el PEG. Lo hacen para obtener fenotipos que no se expresan en sustratos convencionalmente rígidos. Existe un creciente interés en controlar la rigidez de la matriz, [48] un concepto que ha dado lugar a descubrimientos en campos como:

Cultivo celular en tres dimensiones

El cultivo celular en tres dimensiones se ha promocionado como "la nueva dimensión de la biología". [63] En la actualidad, la práctica del cultivo celular sigue basándose en combinaciones variables de estructuras celulares individuales o múltiples en 2D. [64] Actualmente, existe un aumento en el uso de cultivos celulares 3D en áreas de investigación que incluyen el descubrimiento de fármacos , la biología del cáncer, la medicina regenerativa , la evaluación de nanomateriales y la investigación básica en ciencias de la vida . [65] [66] [67] Los cultivos celulares 3D se pueden cultivar utilizando un andamio o matriz, o de una manera sin andamio. Los cultivos basados ​​en andamios utilizan una matriz 3D acelular o una matriz líquida. Los métodos sin andamios normalmente se generan en suspensiones. [68] Existe una variedad de plataformas utilizadas para facilitar el crecimiento de estructuras celulares tridimensionales, incluyendo sistemas de andamiaje como matrices de hidrogel [69] y andamiajes sólidos, y sistemas sin andamiaje como placas de baja adhesión, levitación magnética facilitada por nanopartículas , [70] placas de gotas colgantes, [71] [72] y cultivo celular rotatorio. Cultivar células en 3D conduce a una amplia variación en las firmas de expresión genética y en parte imita los tejidos en los estados fisiológicos. [73] Un modelo de cultivo celular 3D mostró un crecimiento celular similar al in vivo que un cultivo en monocapa, y los tres cultivos fueron capaces de sostener el crecimiento celular. [74] A medida que se ha desarrollado el cultivo 3D, resulta que tiene un gran potencial para diseñar modelos de tumores e investigar la transformación maligna y la metástasis, los cultivos 3D pueden proporcionar una herramienta adicional para comprender los cambios, las interacciones y la señalización celular. [75]

Cultivo de células en 3D en andamios

Eric Simon, en un informe de subvención del NIH SBIR de 1988, demostró que el electrohilado podía utilizarse para producir estructuras fibrosas de poliestireno y policarbonato a escala nanométrica y submicrométrica específicamente diseñadas para su uso como sustratos celulares in vitro . Este uso temprano de redes fibrosas electrohiladas para el cultivo celular y la ingeniería de tejidos demostró que varios tipos de células, incluidos los fibroblastos del prepucio humano (HFF), el carcinoma humano transformado (HEp-2) y el epitelio pulmonar de visón (MLE), se adherirían y proliferarían sobre las fibras de policarbonato. Se observó que, a diferencia de la morfología aplanada que se observa típicamente en el cultivo 2D, las células cultivadas en las fibras electrohiladas exhibían una morfología tridimensional redondeada más histotípica que se observa generalmente in vivo . [17]

Cultivo de células 3D en hidrogeles

Como la matriz extracelular natural (ECM) es importante para la supervivencia, proliferación, diferenciación y migración de las células, se consideran posibles enfoques para el cultivo celular in vivo diferentes matrices de cultivo de hidrogel que imitan la estructura de la ECM natural. [76] Los hidrogeles están compuestos de poros interconectados con alta retención de agua, lo que permite un transporte eficiente de sustancias como nutrientes y gases. Hay varios tipos diferentes de hidrogeles de materiales naturales y sintéticos disponibles para el cultivo celular en 3D, incluidos hidrogeles de extracto de ECM animal, hidrogeles de proteínas, hidrogeles de péptidos, hidrogeles de polímeros e hidrogeles de nanocelulosa a base de madera .

Cultivo de células en 3D mediante levitación magnética

El método de cultivo de células en 3D mediante levitación magnética (MLM) consiste en la aplicación del cultivo de tejido en 3D mediante la inducción de células tratadas con conjuntos de nanopartículas magnéticas en campos magnéticos que varían espacialmente utilizando impulsores magnéticos de neodimio y promoviendo interacciones entre células mediante la levitación de las células hasta la interfaz aire/líquido de una placa de Petri estándar. Los conjuntos de nanopartículas magnéticas consisten en nanopartículas magnéticas de óxido de hierro, nanopartículas de oro y el polímero polilisina. El cultivo de células en 3D es escalable, con la capacidad de cultivar de 500 células a millones de células o desde una sola placa hasta sistemas de bajo volumen de alto rendimiento.

Cultivo e ingeniería de tejidos

El cultivo celular es un componente fundamental del cultivo de tejidos y de la ingeniería de tejidos , ya que establece los principios básicos del crecimiento y el mantenimiento de células in vitro . La principal aplicación del cultivo de células humanas es en la industria de las células madre, donde las células madre mesenquimales se pueden cultivar y criopreservar para su uso futuro. La ingeniería de tejidos ofrece potencialmente mejoras espectaculares en la atención médica de bajo costo para cientos de miles de pacientes al año.

Vacunas

Actualmente, las vacunas contra la polio , el sarampión , las paperas , la rubéola y la varicela se elaboran en cultivos celulares. Debido a la amenaza de pandemia del virus H5N1 , el gobierno de los Estados Unidos está financiando investigaciones sobre el uso de cultivos celulares para vacunas contra la gripe . Entre las ideas novedosas en este campo se incluyen las vacunas basadas en ADN recombinante , como una elaborada utilizando adenovirus humano (un virus del resfriado común) como vector, [77] [78] y nuevos adyuvantes. [79]

Cocultivo celular

La técnica de co-cultivo se utiliza para estudiar la comunicación celular entre dos o más tipos de células en una placa o en una matriz 3D. El cultivo de diferentes células madre y la interacción de las células inmunes se pueden investigar en un modelo in vitro similar al tejido biológico. Dado que la mayoría de los tejidos contienen más de un tipo de célula, es importante evaluar su interacción en un entorno de cultivo 3D para obtener una mejor comprensión de su interacción e introducir tejidos miméticos. Hay dos tipos de co-cultivo: directo e indirecto. Mientras que la interacción directa implica que las células estén en contacto directo entre sí en el mismo medio de cultivo o matriz, la interacción indirecta implica diferentes entornos, lo que permite que participen la señalización y los factores solubles. [15] [80]

La diferenciación celular en modelos de tejido durante la interacción entre células se puede estudiar utilizando el sistema de cocultivo para simular tumores cancerosos, evaluar el efecto de los medicamentos en ensayos terapéuticos y estudiar el efecto de los medicamentos en ensayos terapéuticos. El sistema de cocultivo en modelos 3D puede predecir la respuesta a la quimioterapia y la terapia endocrina si el microambiente define el tejido biológico para las células.

En la ingeniería de tejidos se utiliza un método de cocultivo para generar la formación de tejido con múltiples células que interactúan directamente. [81]

Representación esquemática de cultivo 2D, cultivo 3D, órgano en chip y estudio in vivo

Cultivo celular en dispositivo microfluídico

La técnica de microfluidos consiste en sistemas desarrollados que pueden realizar un proceso en un flujo que normalmente se encuentra en una escala de micrones. Los chips de microfluidos también se conocen como laboratorios en un chip y son capaces de tener pasos de reacción y procedimientos continuos con una cantidad de reactivos y espacio de sobra. Estos sistemas permiten la identificación y el aislamiento de células y moléculas individuales cuando se combinan con ensayos biológicos apropiados y técnicas de detección de alta sensibilidad. [82] [83]

Órgano en un chip

Los sistemas OoC imitan y controlan el microambiente de las células mediante el cultivo de tejidos en microfluidos. Combinando la ingeniería de tejidos, la fabricación de biomateriales y la biología celular, ofrece la posibilidad de establecer un modelo biomimético para estudiar enfermedades humanas en el laboratorio. En los últimos años, la ciencia del cultivo celular en 3D ha logrado un progreso significativo, lo que ha llevado al desarrollo de OoC. OoC se considera un paso preclínico que beneficia los estudios farmacéuticos, el desarrollo de fármacos y el modelado de enfermedades. [84] [85] OoC es una tecnología importante que puede cerrar la brecha entre las pruebas con animales y los estudios clínicos y también, por los avances que la ciencia ha logrado, podría ser un reemplazo para los estudios in vivo para la administración de fármacos y los estudios fisiopatológicos. [86]

Cultivo de células no mamíferas

Además del cultivo de líneas celulares inmortalizadas bien establecidas, las células de explantos primarios de una plétora de organismos pueden cultivarse durante un período de tiempo limitado antes de que se produzca la senescencia (véase el límite de Hayflick). Las células primarias cultivadas se han utilizado ampliamente en la investigación, como es el caso de los queratocitos de peces en estudios de migración celular. [87] [47] [88]

Métodos de cultivo de células vegetales

Los cultivos de células vegetales se cultivan normalmente como cultivos de suspensión celular en un medio líquido o como cultivos de callos en un medio sólido. El cultivo de células vegetales indiferenciadas y callos requiere un equilibrio adecuado de las hormonas de crecimiento vegetal auxina y citoquinina . [ cita requerida ]

Cultivo de células de insectos

Las células derivadas de Drosophila melanogaster (principalmente, las células Schneider 2 ) se pueden utilizar para experimentos que pueden ser difíciles de realizar en moscas vivas o larvas, como estudios bioquímicos o estudios que utilizan ARNi . Las líneas celulares derivadas del gusano soldado Spodoptera frugiperda , incluidas Sf9 y Sf21 , y de la oruga de la col Trichoplusia ni , las células High Five , se utilizan comúnmente para la expresión de proteínas recombinantes utilizando baculovirus . [89]

Métodos de cultivo de bacterias y levaduras.

En el caso de las bacterias y las levaduras, generalmente se cultivan pequeñas cantidades de células en un soporte sólido que contiene nutrientes incorporados, normalmente un gel como el agar, mientras que los cultivos a gran escala se cultivan con las células suspendidas en un caldo nutritivo. [ cita requerida ]

Métodos de cultivo viral

El cultivo de virus requiere el cultivo de células de origen mamífero, vegetal, fúngico o bacteriano como hospedadores para el crecimiento y replicación del virus. Se pueden generar virus de tipo salvaje completos, virus recombinantes o productos virales en tipos de células distintos de sus hospedadores naturales bajo las condiciones adecuadas. Dependiendo de la especie del virus, la infección y la replicación viral pueden resultar en la lisis de la célula hospedadora y la formación de una placa viral . [ cita requerida ]

Líneas celulares comunes

Líneas celulares humanas
Líneas celulares animales
Líneas celulares de ratón
Líneas de células tumorales de rata
Líneas celulares vegetales
Otras líneas celulares de especies

Lista de líneas celulares

Véase también

Referencias y notas

  1. ^ ab Taylor MW (2014). "Una historia del cultivo celular". Virus y hombre: una historia de interacciones . Cham: Springer International Publishing. págs. 41–52. doi :10.1007/978-3-319-07758-1_3. ISBN 978-3-319-07757-4.
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