En la segunda temporada, el tema es la Pesadilla Neogenética en el que Spider-Man continuó con su mutación hasta convertirse en un Monstruo Araña (Man-Spider); en el 1 y 2 capítulo Los Seis Villanos aparecen los 6 Siniestros, como Seis Villanos, (una formación compuesta por Rino, Shocker, Doc.
En el capítulo siguiente, se pasaría a la saga de los Seis Guerreros Olvidados, que se prolonga durante 5 episodios, desde el capítulo 2 hasta el 6, en la cual Peter Parker tiene que viajar a Moscú para descubrir el pasado de sus padres.
Por su parte, en el capítulo 9 La Llegada Spider-Man elige como héroes a Los 4 Fantásticos (en la versión del cómic sólo van tres, la Mujer Invisible se queda porqué está embarazada de su segundo hijo) Iron Man (en los cómics, James Rhodes va en el lugar de Tony), Storm (en la versión del cómic van los X-Men, salvo Kitty Pryde) y el Capitán América.
Estas son: En el capítulo 12 Como detesto los clones van a la realidad del Spider-Man clon (Ben Reilly), en la que está un Spider-Man aliado con el simbionte de Carnage quien tiene la intención de destruir el Multiverso o inclusive el Omniverso.
En el capítulo 13 de la quinta temporada Hasta Luego viaja a la realidad donde es millonario, pero el Spider-Carnage sigue intentando destruir el mundo y se alía con Kingpin, el abogado de Spider-Man, después que Spider-Man ve que su versión millonario no ha cometido errores piensa que solo alguien podría ayudarlo y ese es el tío Ben Parker de ese mundo que está vivo y tras ayudar al Spider-Man del universo del clon a recuperar el sentido de la responsabilidad (este, siguiendo en el capítulo 13, se sacrifica para destruir al simbionte maligno que lo controla).
Se especuló que Hulk, She-Hulk, Ghost Rider o Thor iban a tener una aparición, sin embargo no sucedió.
Se consideró un capítulo con Hulk en la 2.ª temporada y una aparición con She-Hulk en las Secret Wars, sin embargo con el estreno de su propia serie animada, se perdieron sus derechos; Ghost Rider iba a aparecer en una 6.ª temporada cancelada, en el que Spiderman y Ghost Rider se aliasen para vencer a un regreso de Mysterio y Dormammu, sin embargo la serie quedó inconclusa.
Se especuló la aparición de Magneto para el crossover con X-Men: La Serie Animada o Secret Wars, pero no sucedió