Cromatografía líquida de alta eficacia
La cromatografía de fase reversa es tan utilizada, que a menudo se la denomina HPLC sin ninguna especificación adicional.
El efecto hidrofóbico disminuye con la adición de disolvente apolar a la fase móvil.
Aun así, las moléculas muy grandes pueden ver reducida la interacción entre la superficie del compuesto y la fase estacionaria, ya que no pueden entrar en los poros más pequeños de la fase estacionaria.
Otra variable importante es el pH, puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto.
Estos tampones controlan el pH, pero también neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actúan como contraiones que neutralizan la carga del compuesto.
Aun así, muchas columnas de fase reversa están formadas por silica modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con bases en medio acuoso, puesto que éstas podrían dañar el esqueleto de silica subyacente.
Sin embargo, en los casos en que se requiere la caracterización completa de mezclas complejas, todos los componentes de la muestra inyectada en la primera columna se transfieren a la segunda columna.
[6] Hay casos en que se pueden llegar a combinar varias etapas adicionales de separación.
Cuando se da esta situación, la técnica recibe el nombre de HPLC multidimensional.
[7] En cromatografía líquida de reparto en fase inversa (RP-HPLC) lo que se une al soporte de sílice es un líquido apolar o más bien, un radical químico unido covalentemente, lo que le confiere mayor estabilidad a la fase estacionaria, por lo que a veces también se se le denomina cromatografía líquida de fase ligada[7].
Al ser la fase estacionaria muy apolar (las radicales unidos a la sílice pueden ser cadenas hidrocarbonadas de ocho carbonos (C8) o de dieciocho(C18)) para que se produzca el reparto de los solutos entre esta fase y la fase móvil, esta última tiene que ser relativamente polar, por lo que habitualmente se forma mediante mezclas de agua con metanol, acetonitrilo y ocasionalmente tetrahidrofurano, disolventes orgánicos con grupos polares.
En esta cromatografía, la fase estacionaria consiste en largos polímeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa.
A los fines prácticos, la columnas se empaquetan con pequeñas partículas esferoidales formadas por esos polímeros entrecruzados.
Los poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las moléculas que acceden al interior de esta.
Por tanto, las moléculas de mayor tamaño salen en primer lugar de la columna, al quedarse menos retenidas en los poros, mientras que las más pequeñas saldrán en último lugar.
[9] En la cromatografía de intercambio iónico, la retención se basa en la atracción electrostática entre los iones en solución y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria.
En general los intercambiadores iónicos favorecen la unión de iones con elevada carga y radio pequeño.
La separación se realiza en condiciones desnaturalizantes variables, detectándose las moléculas de ADN midiendo la absorbancia a 260 nm.
Los enantiómeros o isómeros ópticos de las sustancias quirales se caracterizan por tener las mismas propiedades químicas y físicas y por consiguiente la misma reactividad química.
Solo se diferencias en su actividad óptica, ya que uno de los enantiómeros gira el plano de la luz polarizada hacia la izquierda (isómero L) mientras que el otro lo hace hacia la derecha (isómero D).
Sin embargo, en la naturaleza, cada enantiómero presenta actividades biológicas muy diferentes entre sí, lo que juega un papel muy importante en numerosos procesos naturales.
En el caso de sustancias xenobióticas, como productos farmacéuticos, agroquímicos, etc., puede ocurrir que cada enantiómero presente comportamientos muy diferentes y por lo general, solamente una de las formas enantioméricas es activa biológicamente tal y como quedó demostrado tras la crisis sanitaria causada por el fármaco talidomida.
[15] Para la separación cromatográfica se puede operar de dos maneras diferentes: Esta segunda opción es la más utilizada en la actualidad y la separación se produce por las diferentes posibilidades de interacción entre los enantiómeros y el selector quiral unido a la fase estacionario.
En cambio, en modo gradiente se aplica cuando los compuestos de la muestra tienen una polaridad muy diferente.
[16] En HPLC isocrática, el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria mediante el bombeo del líquido eluyente (fase móvil) a alta presión manteniendo siempre la misma composición de fase móvil, con lo que no se modifica su poder eluotrópico, es decir, su capacidad de separación.
[17] La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que avanzan por la columna.
Experimentalmente, el modo gradiente se realiza inyectando la muestra en un disolvente con bajo poder de elución.
Por tanto, al aumentar el número de platos, se mejora la separación.
Porter Martin y Richard L. M. Synge adaptaron la teoría de platos teóricos a la cromatografía.
Partículas más pequeñas ofrecen una mayor superficie y una mejor separación, pero la presión que se requiere por obtener una velocidad lineal óptima aumenta de forma inversamente proporcional al cubo del diámetro de la partícula.
