Tecnologías transcriptómicas

Estudio de las transcripciones de ARN

Las tecnologías transcriptómicas son las técnicas que se utilizan para estudiar el transcriptoma de un organismo , la suma de todas sus transcripciones de ARN . El contenido de información de un organismo se registra en el ADN de su genoma y se expresa a través de la transcripción . Aquí, el ARNm sirve como una molécula intermediaria transitoria en la red de información, mientras que los ARN no codificantes realizan diversas funciones adicionales. Un transcriptoma captura una instantánea en el tiempo de las transcripciones totales presentes en una célula . Las tecnologías transcriptómicas proporcionan una descripción amplia de qué procesos celulares están activos y cuáles están inactivos. Un desafío importante en biología molecular es comprender cómo un solo genoma da lugar a una variedad de células. Otro es cómo se regula la expresión genética.

Los primeros intentos de estudiar transcriptomas completos comenzaron a principios de la década de 1990. Los avances tecnológicos posteriores desde finales de la década de 1990 han transformado repetidamente el campo y han hecho de la transcriptómica una disciplina generalizada en las ciencias biológicas. Hay dos técnicas contemporáneas clave en el campo: microarrays , que cuantifican un conjunto de secuencias predeterminadas, y RNA-Seq , que utiliza secuenciación de alto rendimiento para registrar todas las transcripciones. A medida que la tecnología mejoró, aumentó el volumen de datos producidos por cada experimento de transcriptoma. Como resultado, los métodos de análisis de datos se han adaptado constantemente para analizar de manera más precisa y eficiente volúmenes de datos cada vez mayores. Las bases de datos de transcriptomas se están haciendo más grandes y más útiles a medida que los investigadores continúan recopilando y compartiendo transcriptomas. Sería casi imposible interpretar la información contenida en un transcriptoma sin el conocimiento de experimentos previos.

La medición de la expresión de los genes de un organismo en diferentes tejidos o condiciones , o en diferentes momentos, proporciona información sobre cómo se regulan los genes y revela detalles de la biología de un organismo. También se puede utilizar para inferir las funciones de genes que no se habían anotado previamente . El análisis del transcriptoma ha permitido estudiar cómo cambia la expresión genética en diferentes organismos y ha sido fundamental para comprender las enfermedades humanas . Un análisis de la expresión genética en su totalidad permite detectar tendencias amplias coordinadas que no se pueden discernir mediante ensayos más específicos .

Historia

Uso de métodos de transcriptómica a lo largo del tiempo. Artículos publicados que hacen referencia a RNA-Seq (negro), microarray de ARN (rojo), etiqueta de secuencia expresada (azul), visualización diferencial digital (verde) y análisis serial/cap de expresión génica (amarillo) desde 1990. ^[1]

La transcriptómica se ha caracterizado por el desarrollo de nuevas técnicas que han redefinido lo que es posible cada década aproximadamente y han dejado obsoletas las tecnologías anteriores. El primer intento de capturar un transcriptoma humano parcial se publicó en 1991 y se informaron 609 secuencias de ARNm del cerebro humano . ^[2] En 2008, se publicaron dos transcriptomas humanos, compuestos por millones de secuencias derivadas de transcripciones que abarcan 16.000 genes, ^{[3] [4]} y para 2015 se habían publicado transcriptomas de cientos de personas. ^{[5] [6]} Ahora se generan rutinariamente transcriptomas de diferentes estados de enfermedad , tejidos o incluso células individuales. ^{[6] [7] [8]} Esta explosión en la transcriptómica ha sido impulsada por el rápido desarrollo de nuevas tecnologías con una sensibilidad y una economía mejoradas. ^{[9] [10] [11] [12]}

Antes de la transcriptómica

Los estudios de transcripciones individuales se estaban realizando varias décadas antes de que estuvieran disponibles los enfoques transcriptómicos. A fines de la década de 1970, se recopilaron bibliotecas de transcripciones de ARNm de polilla de seda y se convirtieron en ADN complementario (ADNc) para su almacenamiento utilizando transcriptasa inversa . ^[13] En la década de 1980, se utilizó la secuenciación de bajo rendimiento utilizando el método Sanger para secuenciar transcripciones aleatorias, produciendo etiquetas de secuencia expresada (EST). ^{[2] [14] [15] [16]} El método de secuenciación Sanger fue predominante hasta la llegada de métodos de alto rendimiento como la secuenciación por síntesis (Solexa/Illumina). Las EST cobraron importancia durante la década de 1990 como un método eficiente para determinar el contenido genético de un organismo sin secuenciar todo el genoma . ^[16] Se cuantificaron las cantidades de transcripciones individuales utilizando transferencia Northern , matrices de membrana de nailon y, posteriormente, métodos de PCR cuantitativa con transcriptasa inversa (RT-qPCR), ^{[17] [18]} pero estos métodos son laboriosos y solo pueden capturar una pequeña subsección de un transcriptoma. ^[12] En consecuencia, la forma en que se expresa y regula un transcriptoma en su totalidad permaneció desconocida hasta que se desarrollaron técnicas de mayor rendimiento.

Primeros intentos

La palabra "transcriptoma" se utilizó por primera vez en la década de 1990. ^{[19] [20]} En 1995, se desarrolló uno de los primeros métodos transcriptómicos basados ​​en secuenciación, el análisis serial de la expresión génica (SAGE), que funcionaba mediante la secuenciación de Sanger de fragmentos de transcripción aleatorios concatenados. ^[21] Las transcripciones se cuantificaban haciendo coincidir los fragmentos con genes conocidos. También se utilizó brevemente una variante de SAGE que utiliza técnicas de secuenciación de alto rendimiento, llamada análisis digital de la expresión génica. ^{[9] [22]} Sin embargo, estos métodos fueron superados en gran medida por la secuenciación de alto rendimiento de transcripciones completas, que proporcionó información adicional sobre la estructura de la transcripción, como las variantes de empalme . ^[9]

Desarrollo de técnicas contemporáneas

Las técnicas contemporáneas dominantes, microarrays y RNA-Seq , se desarrollaron a mediados de los años 1990 y 2000. ^{[9] [33]} Los microarrays que miden las abundancias de un conjunto definido de transcripciones a través de su hibridación con una matriz de sondas complementarias se publicaron por primera vez en 1995. ^{[34] [35]} La tecnología de microarrays permitió el ensayo de miles de transcripciones simultáneamente y a un costo por gen muy reducido y ahorro de mano de obra. ^[36] Tanto las matrices de oligonucleótidos manchados como las matrices de alta densidad Affymetrix fueron el método de elección para el perfil transcripcional hasta finales de la década de 2000. ^{[12] [33]} Durante este período, se produjo una gama de microarrays para cubrir genes conocidos en organismos modelo o económicamente importantes. Los avances en el diseño y la fabricación de matrices mejoraron la especificidad de las sondas y permitieron probar más genes en una sola matriz. Los avances en la detección de fluorescencia aumentaron la sensibilidad y la precisión de la medición para transcripciones de baja abundancia. ^{[35] [37]}

La RNA-Seq se logra mediante la transcripción inversa del ARN in vitro y la secuenciación de los ADNc resultantes . ^[10] La abundancia de transcripciones se deriva del número de recuentos de cada transcripción. Por lo tanto, la técnica ha sido fuertemente influenciada por el desarrollo de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento . ^{[9] [11]} La secuenciación masiva de firmas paralelas (MPSS) fue un ejemplo temprano basado en la generación de secuencias de 16-20  pb a través de una serie compleja de hibridaciones , ^{[38] [nota 1]} y se utilizó en 2004 para validar la expresión de diez mil genes en Arabidopsis thaliana . ^[39] El primer trabajo de RNA-Seq se publicó en 2006 con cien mil transcripciones secuenciadas utilizando la tecnología 454. ^[40] Esta fue una cobertura suficiente para cuantificar la abundancia relativa de transcripciones . La RNA-Seq comenzó a aumentar en popularidad después de 2008 cuando las nuevas tecnologías Solexa/Illumina permitieron registrar mil millones de secuencias de transcripciones. ^{[4] [10] [41] [42]} Este rendimiento ahora permite la cuantificación y comparación de los transcriptomas humanos. ^[43]

Recopilación de datos

La generación de datos sobre transcripciones de ARN se puede lograr a través de cualquiera de dos principios principales: secuenciación de transcripciones individuales ( EST o RNA-Seq) o hibridación de transcripciones a una matriz ordenada de sondas de nucleótidos (microarreglos). ^[23]

Aislamiento de ARN

Todos los métodos transcriptómicos requieren que primero se aísle el ARN del organismo experimental antes de que se puedan registrar las transcripciones. Aunque los sistemas biológicos son increíblemente diversos, las técnicas de extracción de ARN son ampliamente similares e implican la interrupción mecánica de células o tejidos, la interrupción de la ARNasa con sales caotrópicas , ^[44] la interrupción de macromoléculas y complejos de nucleótidos, la separación del ARN de biomoléculas no deseadas , incluido el ADN, y la concentración del ARN mediante precipitación de la solución o elución de una matriz sólida . ^{[44] [45]} El ARN aislado también puede tratarse con ADNasa para digerir cualquier rastro de ADN. ^[46] Es necesario enriquecer el ARN mensajero, ya que los extractos de ARN totales suelen ser 98% ARN ribosómico . ^[47] El enriquecimiento de las transcripciones se puede realizar mediante métodos de afinidad de poli-A o mediante el agotamiento del ARN ribosómico utilizando sondas específicas de secuencia. ^[48] El ARN degradado puede afectar los resultados posteriores; Por ejemplo, el enriquecimiento de ARNm a partir de muestras degradadas dará como resultado el agotamiento de los extremos 5' del ARNm y una señal desigual a lo largo de la transcripción. La congelación rápida del tejido antes del aislamiento del ARN es típica, y se toman precauciones para reducir la exposición a las enzimas ARNasas una vez que se completa el aislamiento. ^[45]

Etiquetas de secuencia expresada

Una etiqueta de secuencia expresada (EST, por sus siglas en inglés) es una secuencia corta de nucleótidos generada a partir de una única transcripción de ARN. El ARN se copia primero como ADN complementario (ADNc) por una enzima transcriptasa inversa antes de que se secuencie el ADNc resultante. ^[16] Debido a que las EST se pueden recolectar sin conocimiento previo del organismo del que provienen, se pueden hacer a partir de mezclas de organismos o muestras ambientales. ^{[49] [16]} Aunque ahora se utilizan métodos de mayor rendimiento, las bibliotecas de EST comúnmente proporcionaban información de secuencia para los primeros diseños de microarrays; por ejemplo, se diseñó un microarray de cebada a partir de 350.000 EST secuenciados previamente. ^[50]

Análisis serial y de cap de la expresión génica (SAGE/CAGE)

Resumen de SAGE . Dentro de los organismos, los genes se transcriben y empalman (en eucariotas ) para producir transcripciones de ARNm maduros (rojo). El ARNm se extrae del organismo y se utiliza la transcriptasa inversa para copiar el ARNm en ADNc de doble cadena estable ( ds - cDNA ; azul). En SAGE, el ds-cDNA es digerido por enzimas de restricción (en la ubicación 'X' y 'X'+11) para producir fragmentos de "etiqueta" de 11 nucleótidos. Estas etiquetas se concatenan y secuencian utilizando la secuenciación de Sanger de lectura larga (diferentes tonos de azul indican etiquetas de diferentes genes). Las secuencias se deconvolucionan para encontrar la frecuencia de cada etiqueta. La frecuencia de la etiqueta se puede utilizar para informar sobre la transcripción del gen del que proviene la etiqueta. ^[51]

El análisis serial de la expresión génica (SAGE) fue un desarrollo de la metodología EST para aumentar el rendimiento de las etiquetas generadas y permitir cierta cuantificación de la abundancia de transcripción. ^[21] El ADNc se genera a partir del ARN , pero luego se digiere en fragmentos de "etiqueta" de 11 pb utilizando enzimas de restricción que cortan el ADN en una secuencia específica y 11 pares de bases a lo largo de esa secuencia. Estas etiquetas de ADNc luego se unen de cabeza a cola en cadenas largas (>500 pb) y se secuencian utilizando métodos de bajo rendimiento, pero de longitud de lectura larga, como la secuenciación de Sanger . Luego, las secuencias se dividen nuevamente en sus etiquetas originales de 11 pb utilizando un software de computadora en un proceso llamado deconvolución . ^{[21] Si se dispone de un} genoma de referencia de alta calidad , estas etiquetas se pueden hacer coincidir con su gen correspondiente en el genoma. Si no se dispone de un genoma de referencia, las etiquetas se pueden usar directamente como marcadores de diagnóstico si se descubre que se expresan de manera diferencial en un estado de enfermedad. ^[21]

El método de análisis de expresión génica por capuchón (CAGE) es una variante de SAGE que secuencia las etiquetas solo desde el extremo 5' de una transcripción de ARNm. ^[52] Por lo tanto, el sitio de inicio de la transcripción de los genes se puede identificar cuando las etiquetas se alinean con un genoma de referencia. La identificación de los sitios de inicio de los genes es útil para el análisis de promotores y para la clonación de ADNc de longitud completa.

Los métodos SAGE y CAGE producen información sobre más genes de lo que era posible al secuenciar EST individuales, pero la preparación de muestras y el análisis de datos suelen requerir más trabajo. ^[52]

Microarrays

Resumen de los microarrays de ADN . Dentro de los organismos, los genes se transcriben y se unen (en eucariotas) para producir transcripciones de ARNm maduros (rojo). El ARNm se extrae del organismo y se utiliza la transcriptasa inversa para copiar el ARNm en ADNc bicatenario estable (azul). En los microarrays, el ADNc bicatenario se fragmenta y se marca con fluorescencia (naranja). Los fragmentos marcados se unen a un conjunto ordenado de oligonucleótidos complementarios, y la medición de la intensidad de la fluorescencia en el conjunto indica la abundancia de un conjunto predeterminado de secuencias. Estas secuencias se eligen típicamente de forma específica para informar sobre genes de interés dentro del genoma del organismo. ^[51]

Principios y avances

Los microarrays generalmente consisten en una cuadrícula de oligómeros de nucleótidos cortos , conocidos como " sondas ", generalmente dispuestos en un portaobjetos de vidrio. ^[53] La abundancia de transcripciones se determina mediante la hibridación de transcripciones marcadas con fluorescencia con estas sondas. ^[54] La intensidad de fluorescencia en cada ubicación de la sonda en el arreglo indica la abundancia de transcripciones para esa secuencia de sonda. ^[54] Los grupos de sondas diseñados para medir la misma transcripción (es decir, hibridar una transcripción específica en diferentes posiciones) generalmente se denominan "conjuntos de sondas".

Los microarrays requieren cierto conocimiento genómico del organismo de interés, por ejemplo, en forma de una secuencia genómica anotada o una biblioteca de EST que se pueda utilizar para generar las sondas para el arreglo. ^[36]

Métodos

Los microarrays para la transcriptómica suelen pertenecer a una de dos grandes categorías: arrays de puntos de baja densidad o arrays de sondas cortas de alta densidad. La abundancia de transcripciones se infiere a partir de la intensidad de la fluorescencia derivada de las transcripciones marcadas con fluoróforos que se unen al array. ^[36]

Los arrays de baja densidad con puntos suelen presentar gotas de picolitros ^{[nota 2]} de una variedad de ADNc purificados dispuestos sobre la superficie de un portaobjetos de vidrio. ^[55] Estas sondas son más largas que las de los arrays de alta densidad y no pueden identificar eventos de empalme alternativo . Los arrays con puntos utilizan dos fluoróforos diferentes para etiquetar las muestras de prueba y de control, y la relación de fluorescencia se utiliza para calcular una medida relativa de abundancia. ^[56] Los arrays de alta densidad utilizan una sola etiqueta fluorescente, y cada muestra se hibrida y se detecta individualmente. ^[57] Los arrays de alta densidad se popularizaron con el array GeneChip de Affymetrix , donde cada transcripción se cuantifica mediante varias sondas cortas de 25 mer que en conjunto analizan un gen. ^[58]

Las matrices NimbleGen eran matrices de alta densidad producidas mediante un método de fotoquímica sin máscara , que permitía la fabricación flexible de matrices en cantidades pequeñas o grandes. Estas matrices tenían cientos de miles de sondas de 45 a 85 meros y se hibridaban con una muestra etiquetada con un solo color para el análisis de expresión. ^[59] Algunos diseños incorporaban hasta 12 matrices independientes por portaobjetos.

Secuenciación de ARN

Resumen de RNA-Seq . Dentro de los organismos, los genes se transcriben y se empalman (en eucariotas) para producir transcripciones de ARNm maduros (rojo). El ARNm se extrae del organismo, se fragmenta y se copia en un ds-cDNA estable (azul). El ds-cDNA se secuencia utilizando métodos de secuenciación de lectura corta y alto rendimiento . Estas secuencias se pueden alinear luego con una secuencia de genoma de referencia para reconstruir qué regiones del genoma se estaban transcribiendo. Estos datos se pueden utilizar para anotar dónde se expresan los genes, sus niveles de expresión relativos y cualquier variante de empalme alternativa. ^[51]

Principios y avances

RNA-Seq se refiere a la combinación de una metodología de secuenciación de alto rendimiento con métodos computacionales para capturar y cuantificar las transcripciones presentes en un extracto de ARN. ^[10] Las secuencias de nucleótidos generadas suelen tener alrededor de 100 pb de longitud, pero pueden variar de 30 pb a más de 10 000 pb según el método de secuenciación utilizado. RNA-Seq aprovecha el muestreo profundo del transcriptoma con muchos fragmentos cortos de un transcriptoma para permitir la reconstrucción computacional de la transcripción de ARN original alineando las lecturas con un genoma de referencia o entre sí ( ensamblaje de novo ). ^[9] Tanto los ARN de baja abundancia como los de alta abundancia se pueden cuantificar en un experimento de RNA-Seq ( rango dinámico de 5 órdenes de magnitud ), una ventaja clave sobre los transcriptomas de microarrays. Además, las cantidades de ARN de entrada son mucho menores para RNA-Seq (cantidad de nanogramos) en comparación con los microarrays (cantidad de microgramos), que permiten el examen del transcriptoma incluso con una resolución de una sola célula cuando se combina con la amplificación de ADNc. ^{[25] [60]} Teóricamente, no hay un límite superior de cuantificación en RNA-Seq, y el ruido de fondo es muy bajo para lecturas de 100 pb en regiones no repetitivas. ^[10]

La secuenciación de ARN se puede utilizar para identificar genes dentro de un genoma o identificar qué genes están activos en un momento determinado, y los recuentos de lecturas se pueden utilizar para modelar con precisión el nivel relativo de expresión génica. La metodología de la secuenciación de ARN ha mejorado constantemente, principalmente a través del desarrollo de tecnologías de secuenciación de ADN para aumentar el rendimiento, la precisión y la longitud de lectura. ^[61] Desde las primeras descripciones en 2006 y 2008, ^{[40] [62]} la secuenciación de ARN se ha adoptado rápidamente y superó a los microarrays como la técnica transcriptómica dominante en 2015. ^[63]

La búsqueda de datos del transcriptoma a nivel de células individuales ha impulsado avances en los métodos de preparación de bibliotecas de ARN-Seq, lo que ha dado como resultado avances espectaculares en la sensibilidad. Los transcriptomas de células individuales están ahora bien descritos e incluso se han extendido al ARN-Seq in situ , donde los transcriptomas de células individuales se interrogan directamente en tejidos fijados . ^[64]

Métodos

La secuenciación de ARN se creó en consonancia con el rápido desarrollo de una gama de tecnologías de secuenciación de ADN de alto rendimiento. ^[65] Sin embargo, antes de secuenciar las transcripciones de ARN extraídas, se realizan varios pasos de procesamiento clave. Los métodos difieren en el uso de enriquecimiento de la transcripción, fragmentación, amplificación, secuenciación de extremos simples o emparejados y en si se debe preservar la información de la cadena. ^[65]

La sensibilidad de un experimento de RNA-Seq se puede aumentar enriqueciendo las clases de ARN que son de interés y agotando los ARN abundantes conocidos. Las moléculas de ARNm se pueden separar utilizando sondas de oligonucleótidos que unen sus colas de poli-A . Alternativamente, la ribo-depleción se puede utilizar para eliminar específicamente los ARN ribosómicos (ARNr) abundantes pero no informativos mediante hibridación con sondas adaptadas a las secuencias de ARNr específicas del taxón (por ejemplo, ARNr de mamíferos, ARNr de plantas). Sin embargo, la ribo-depleción también puede introducir algún sesgo a través del agotamiento no específico de transcripciones fuera del objetivo. ^[66] Los ARN pequeños, como los micro ARN , se pueden purificar en función de su tamaño mediante electroforesis en gel y extracción.

Dado que los ARNm son más largos que las longitudes de lectura de los métodos de secuenciación de alto rendimiento típicos, las transcripciones suelen fragmentarse antes de la secuenciación. ^[67] El método de fragmentación es un aspecto clave de la construcción de la biblioteca de secuenciación. La fragmentación se puede lograr mediante hidrólisis química , nebulización , sonicación o transcripción inversa con nucleótidos de terminación de cadena . ^[67] Alternativamente, la fragmentación y el etiquetado de ADNc se pueden realizar simultáneamente mediante el uso de enzimas transposasas . ^[68]

Durante la preparación para la secuenciación, las copias de ADNc de las transcripciones pueden amplificarse por PCR para enriquecer los fragmentos que contienen las secuencias adaptadoras 5' y 3' esperadas. ^[69] La amplificación también se utiliza para permitir la secuenciación de cantidades de entrada muy bajas de ARN, hasta tan solo 50 pg en aplicaciones extremas. ^[70] Los controles de adición de ARN conocidos se pueden utilizar para la evaluación del control de calidad para verificar la preparación y secuenciación de la biblioteca, en términos de contenido de GC , longitud del fragmento, así como el sesgo debido a la posición del fragmento dentro de una transcripción. ^[71] Los identificadores moleculares únicos (UMI) son secuencias aleatorias cortas que se utilizan para etiquetar individualmente fragmentos de secuencia durante la preparación de la biblioteca de modo que cada fragmento etiquetado sea único. ^[72] Los UMI proporcionan una escala absoluta para la cuantificación, la oportunidad de corregir el sesgo de amplificación posterior introducido durante la construcción de la biblioteca y estimar con precisión el tamaño de muestra inicial. Los UMI son particularmente adecuados para la transcriptómica de ARN-Seq de una sola célula, donde la cantidad de ARN de entrada está restringida y se requiere una amplificación extendida de la muestra. ^{[73] [74] [75]}

Una vez que se han preparado las moléculas de transcripción, se pueden secuenciar en una sola dirección (single-end) o en ambas direcciones (paired-end). Una secuencia de un solo extremo suele ser más rápida de producir, más barata que la secuenciación de paired-end y suficiente para la cuantificación de los niveles de expresión génica. La secuenciación de paired-end produce alineaciones/ensamblajes más robustos, lo que es beneficioso para la anotación génica y el descubrimiento de isoformas de transcripción . ^[10] Los métodos de secuenciación de ARN específicos de la hebra conservan la información de la hebra de una transcripción secuenciada. ^[76] Sin información de la hebra, las lecturas se pueden alinear con un locus génico pero no informan en qué dirección se transcribe el gen. La secuenciación de ARN de hebra es útil para descifrar la transcripción de genes que se superponen en diferentes direcciones y para hacer predicciones génicas más robustas en organismos no modelo. ^[76]

Leyenda: NCBI SRA – Archivo de lectura de secuencias del Centro nacional de información biotecnológica.

Actualmente, la secuenciación de ARN se basa en copiar moléculas de ARN en moléculas de ADNc antes de la secuenciación; por lo tanto, las plataformas posteriores son las mismas para los datos transcriptómicos y genómicos. En consecuencia, el desarrollo de tecnologías de secuenciación de ADN ha sido una característica definitoria de la secuenciación de ARN. ^{[78] [80] [81]} La secuenciación directa de ARN mediante secuenciación por nanoporos representa una técnica de última generación de la secuenciación de ARN. ^{[82] [83]} La secuenciación por nanoporos de ARN puede detectar bases modificadas que de otro modo quedarían enmascaradas al secuenciar ADNc y también elimina los pasos de amplificación que de otro modo pueden introducir sesgos. ^{[11] [84]}

La sensibilidad y precisión de un experimento de RNA-Seq dependen del número de lecturas obtenidas de cada muestra. ^{[85] [86]} Se necesita un gran número de lecturas para asegurar una cobertura suficiente del transcriptoma, lo que permite la detección de transcripciones de baja abundancia. El diseño experimental se complica aún más por las tecnologías de secuenciación con un rango de salida limitado, la eficiencia variable de la creación de secuencias y la calidad variable de las secuencias. A estas consideraciones se suma que cada especie tiene un número diferente de genes y, por lo tanto, requiere un rendimiento de secuencia personalizado para un transcriptoma efectivo. Los primeros estudios determinaron los umbrales adecuados empíricamente, pero a medida que la tecnología maduró, la cobertura adecuada se predijo computacionalmente por la saturación del transcriptoma. De manera algo contraria a la intuición, la forma más eficaz de mejorar la detección de la expresión diferencial en genes de baja expresión es agregar más réplicas biológicas en lugar de agregar más lecturas. ^[87] Los puntos de referencia actuales recomendados por el Proyecto Enciclopedia de Elementos de ADN (ENCODE) son una cobertura del exoma de 70 veces para el ARN-Seq estándar y una cobertura del exoma de hasta 500 veces para detectar transcripciones e isoformas raras. ^{[88] [89] [90]}

Análisis de datos

Los métodos transcriptómicos son altamente paralelos y requieren un cálculo significativo para producir datos significativos tanto para experimentos de microarrays como de RNA-Seq. ^{[91] [92] [93] [94] [95]} Los datos de microarrays se registran como imágenes de alta resolución , lo que requiere detección de características y análisis espectral. ^[96] Los archivos de imágenes sin procesar de microarrays tienen un tamaño de aproximadamente 750 MB cada uno, mientras que las intensidades procesadas tienen un tamaño de alrededor de 60 MB. Múltiples sondas cortas que coincidan con una sola transcripción pueden revelar detalles sobre la estructura intrón - exón , lo que requiere modelos estadísticos para determinar la autenticidad de la señal resultante. Los estudios de RNA-Seq producen miles de millones de secuencias cortas de ADN, que deben alinearse con genomas de referencia compuestos de millones a miles de millones de pares de bases. El ensamblaje de novo de lecturas dentro de un conjunto de datos requiere la construcción de gráficos de secuencia altamente complejos . ^[97] Las operaciones de RNA-Seq son altamente repetitivas y se benefician de la computación en paralelo , pero los algoritmos modernos significan que el hardware informático del consumidor es suficiente para experimentos de transcriptómica simples que no requieren un ensamblaje de novo de lecturas. ^[98] Un transcriptoma humano podría capturarse con precisión utilizando RNA-Seq con 30 millones de secuencias de 100 pb por muestra. ^{[85] [86]} Este ejemplo requeriría aproximadamente 1,8 gigabytes de espacio en disco por muestra cuando se almacena en un formato fastq comprimido . Los datos de recuento procesados ​​para cada gen serían mucho más pequeños, equivalentes a las intensidades de microarray procesadas. Los datos de secuencia se pueden almacenar en repositorios públicos, como el Sequence Read Archive (SRA). ^[99] Los conjuntos de datos de RNA-Seq se pueden cargar a través del Gene Expression Omnibus. ^[100]

Procesamiento de imágenes

Celda de flujo de secuenciación y microarrays . Los microarrays y la secuenciación de ARN dependen del análisis de imágenes de diferentes maneras. En un chip de microarrays, cada punto del chip es una sonda de oligonucleótidos definida, y la intensidad de fluorescencia detecta directamente la abundancia de una secuencia específica (Affymetrix). En una celda de flujo de secuenciación de alto rendimiento, los puntos se secuencian un nucleótido a la vez, y el color de cada ronda indica el siguiente nucleótido en la secuencia (Illumina Hiseq). Otras variaciones de estas técnicas utilizan más o menos canales de color. ^{[51] [101]}

El procesamiento de imágenes de microarrays debe identificar correctamente la cuadrícula regular de características dentro de una imagen y cuantificar de forma independiente la intensidad de fluorescencia para cada característica. Los artefactos de la imagen deben identificarse adicionalmente y eliminarse del análisis general. Las intensidades de fluorescencia indican directamente la abundancia de cada secuencia, ya que la secuencia de cada sonda en el array ya se conoce. ^[102]

Los primeros pasos de la secuenciación de ARN también incluyen un procesamiento de imágenes similar; sin embargo, la conversión de imágenes a datos de secuenciación generalmente se maneja automáticamente por el software del instrumento. El método de secuenciación por síntesis de Illumina da como resultado una matriz de grupos distribuidos sobre la superficie de una celda de flujo. ^[103] La celda de flujo se visualiza hasta cuatro veces durante cada ciclo de secuenciación, con decenas a cientos de ciclos en total. Los grupos de celdas de flujo son análogos a los puntos de microarray y deben identificarse correctamente durante las primeras etapas del proceso de secuenciación. En el método de pirosecuenciación de Roche , la intensidad de la luz emitida determina el número de nucleótidos consecutivos en una repetición de homopolímero. Hay muchas variantes de estos métodos, cada una con un perfil de error diferente para los datos resultantes. ^[104]

Análisis de datos de RNA-Seq

Los experimentos de RNA-Seq generan un gran volumen de lecturas de secuencias sin procesar que deben procesarse para obtener información útil. El análisis de datos generalmente requiere una combinación de herramientas de software bioinformático (consulte también la Lista de herramientas bioinformáticas de RNA-Seq ) que varían según el diseño y los objetivos experimentales. El proceso se puede dividir en cuatro etapas: control de calidad, alineación, cuantificación y expresión diferencial. ^[105] La mayoría de los programas de RNA-Seq más populares se ejecutan desde una interfaz de línea de comandos , ya sea en un entorno Unix o dentro del entorno estadístico R / Bioconductor . ^[94]

Control de calidad

Las lecturas de secuencias no son perfectas, por lo que es necesario estimar la precisión de cada base en la secuencia para los análisis posteriores. Los datos sin procesar se examinan para garantizar: que los puntajes de calidad para las llamadas de bases sean altos, que el contenido de GC coincida con la distribución esperada, que los motivos de secuencia cortos ( k-mers ) no estén sobrerrepresentados y que la tasa de duplicación de lecturas sea aceptablemente baja. ^[86] Existen varias opciones de software para el análisis de la calidad de las secuencias, incluidos FastQC y FaQCs. ^{[106] [107]} Las anomalías se pueden eliminar (recortar) o etiquetar para un tratamiento especial durante procesos posteriores.

Alineación

Para vincular la abundancia de lecturas de secuencias con la expresión de un gen particular, las secuencias de transcripción se alinean con un genoma de referencia o se alinean de novo entre sí si no hay una referencia disponible. ^{[108] [109] [110]} Los desafíos clave para el software de alineación incluyen la velocidad suficiente para permitir que miles de millones de secuencias cortas se alineen en un período de tiempo significativo, la flexibilidad para reconocer y tratar el empalme de intrones del ARNm eucariota y la asignación correcta de lecturas que se asignan a múltiples ubicaciones. Los avances del software han abordado en gran medida estos problemas, y los aumentos en la longitud de lectura de secuenciación reducen la posibilidad de alineaciones de lecturas ambiguas. El EBI mantiene una lista de alineadores de secuencias de alto rendimiento actualmente disponibles . ^{[111] [112]}

La alineación de secuencias de ARNm de transcripción primaria derivadas de eucariotas con un genoma de referencia requiere un manejo especializado de secuencias de intrones , que están ausentes en el ARNm maduro. ^[113] Los alineadores de lectura corta realizan una ronda adicional de alineaciones diseñadas específicamente para identificar uniones de empalme , informadas por secuencias de sitios de empalme canónicos e información conocida del sitio de empalme de intrones. La identificación de uniones de empalme de intrones evita que las lecturas se desalineen en las uniones de empalme o se descarten por error, lo que permite alinear más lecturas con el genoma de referencia y mejora la precisión de las estimaciones de expresión génica. Dado que la regulación génica puede ocurrir a nivel de isoforma de ARNm , las alineaciones con reconocimiento de empalme también permiten la detección de cambios en la abundancia de isoformas que de otro modo se perderían en un análisis masivo. ^[114]

El ensamblaje de novo se puede utilizar para alinear lecturas entre sí para construir secuencias de transcripción de longitud completa sin el uso de un genoma de referencia. ^[115] Los desafíos particulares del ensamblaje de novo incluyen mayores requisitos computacionales en comparación con un transcriptoma basado en referencia, validación adicional de variantes o fragmentos de genes y anotación adicional de transcripciones ensambladas. Se ha demostrado que las primeras métricas utilizadas para describir ensamblajes de transcriptomas, como N50 , son engañosas ^[116] y ahora hay disponibles métodos de evaluación mejorados. ^{[117] [118]} Las métricas basadas en anotaciones son mejores evaluaciones de la integridad del ensamblaje, como el recuento de mejores aciertos recíprocos de contig . Una vez ensamblado de novo , el ensamblaje se puede utilizar como referencia para métodos de alineación de secuencias posteriores y análisis cuantitativo de expresión genética.

Leyenda: RAM – memoria de acceso aleatorio; MPI – interfaz de paso de mensajes; EST – etiqueta de secuencia expresada.

Cuantificación

Identificación mediante mapas de calor de patrones de coexpresión genética en diferentes muestras. Cada columna contiene las mediciones de cambio de expresión genética para una sola muestra. La expresión genética relativa se indica mediante colores: expresión alta (rojo), expresión media (blanco) y expresión baja (azul). Los genes y las muestras con perfiles de expresión similares se pueden agrupar automáticamente (árboles de la izquierda y superior). Las muestras pueden ser diferentes individuos, tejidos, entornos o condiciones de salud. En este ejemplo, la expresión del conjunto de genes 1 es alta y la expresión del conjunto de genes 2 es baja en las muestras 1, 2 y 3. ^{[51] [129]}

La cuantificación de alineaciones de secuencias se puede realizar a nivel de gen, exón o transcripción. ^{[91] [87]} Los resultados típicos incluyen una tabla de recuentos de lecturas para cada característica suministrada al software; por ejemplo, para genes en un archivo de formato de característica general . Los recuentos de lecturas de genes y exones se pueden calcular con bastante facilidad utilizando HTSeq, por ejemplo. ^[130] La cuantificación a nivel de transcripción es más complicada y requiere métodos probabilísticos para estimar la abundancia de isoformas de transcripción a partir de información de lectura corta; por ejemplo, utilizando el software cufflinks. ^[114] Las lecturas que se alinean igualmente bien con múltiples ubicaciones deben identificarse y eliminarse, alinearse con una de las ubicaciones posibles o alinearse con la ubicación más probable.

Algunos métodos de cuantificación pueden obviar por completo la necesidad de una alineación exacta de una lectura con una secuencia de referencia. El método del software kallisto combina la pseudoalineación y la cuantificación en un solo paso que se ejecuta dos órdenes de magnitud más rápido que los métodos contemporáneos, como los utilizados por el software tophat/cufflinks, con una carga computacional menor. ^[131]

Expresión diferencial

Una vez que se dispone de los recuentos cuantitativos de cada transcripción, se mide la expresión genética diferencial mediante la normalización, el modelado y el análisis estadístico de los datos. ^[108] La mayoría de las herramientas leerán una tabla de genes y leerán los recuentos como entrada, pero algunos programas, como cuffdiff, aceptarán alineaciones de lectura en formato de mapa de alineamiento binario como entrada. Los resultados finales de estos análisis son listas de genes con pruebas por pares asociadas para la expresión diferencial entre tratamientos y las estimaciones de probabilidad de esas diferencias. ^[132]

Leyenda: ARNm - ARN mensajero.

Validación

Los análisis transcriptómicos pueden validarse utilizando una técnica independiente, por ejemplo, PCR cuantitativa (qPCR), que es reconocible y evaluable estadísticamente. ^[135] La expresión génica se mide contra estándares definidos tanto para el gen de interés como para los genes de control . La medición por qPCR es similar a la obtenida por RNA-Seq en la que se puede calcular un valor para la concentración de una región objetivo en una muestra dada. Sin embargo, la qPCR está restringida a amplicones menores de 300 pb, generalmente hacia el extremo 3' de la región codificante, evitando el 3'UTR . ^[136] Si se requiere la validación de las isoformas de transcripción, una inspección de las alineaciones de lectura de RNA-Seq debe indicar dónde se pueden colocar los cebadores de qPCR para una máxima discriminación. La medición de múltiples genes de control junto con los genes de interés produce una referencia estable dentro de un contexto biológico. ^[137] La ​​validación por qPCR de los datos de RNA-Seq generalmente ha demostrado que los diferentes métodos de RNA-Seq están altamente correlacionados. ^{[62] [138] [139]}

La validación funcional de genes clave es una consideración importante para la planificación post-transcriptómica. Los patrones de expresión génica observados pueden vincularse funcionalmente a un fenotipo mediante un estudio independiente de eliminación / rescate en el organismo de interés. ^[140]

Aplicaciones

Diagnóstico y perfil de enfermedades

Las estrategias transcriptómicas han tenido una amplia aplicación en diversas áreas de la investigación biomédica, incluido el diagnóstico y el perfil de enfermedades . ^{[10] [141]} Los enfoques de RNA-Seq han permitido la identificación a gran escala de sitios de inicio de la transcripción , el uso de promotores alternativos descubiertos y nuevas alteraciones de empalme . Estos elementos reguladores son importantes en la enfermedad humana y, por lo tanto, definir tales variantes es crucial para la interpretación de los estudios de asociación de enfermedades . ^[142] RNA-Seq también puede identificar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) asociados a la enfermedad, expresión específica de alelos y fusiones de genes , lo que contribuye a la comprensión de las variantes causales de la enfermedad. ^[143]

Los retrotransposones son elementos transponibles que proliferan dentro de los genomas eucariotas a través de un proceso que implica transcripción inversa . RNA-Seq puede proporcionar información sobre la transcripción de retrotransposones endógenos que pueden influir en la transcripción de genes vecinos por varios mecanismos epigenéticos que conducen a la enfermedad. ^[144] De manera similar, el potencial para usar RNA-Seq para comprender la enfermedad relacionada con el sistema inmunológico se está expandiendo rápidamente debido a la capacidad de diseccionar poblaciones de células inmunes y secuenciar repertorios de receptores de células T y células B de pacientes. ^{[145] [146]}

Transcriptomas humanos y patógenos

La secuenciación de ARN de patógenos humanos se ha convertido en un método establecido para cuantificar los cambios en la expresión genética, identificar nuevos factores de virulencia , predecir la resistencia a los antibióticos y descubrir interacciones inmunitarias entre el huésped y el patógeno . ^{[147] [148]} Un objetivo principal de esta tecnología es desarrollar medidas optimizadas de control de infecciones y un tratamiento individualizado específico . ^[146]

El análisis transcriptómico se ha centrado predominantemente en el huésped o en el patógeno. Se ha aplicado la secuenciación dual de ARN para perfilar simultáneamente la expresión de ARN tanto en el patógeno como en el huésped durante todo el proceso de infección. Esta técnica permite el estudio de la respuesta dinámica y las redes de regulación de genes entre especies en ambos socios de interacción desde el contacto inicial hasta la invasión y la persistencia final del patógeno o su eliminación por el sistema inmunológico del huésped. ^{[149] [150]}

Respuestas al medio ambiente

La transcriptómica permite la identificación de genes y vías que responden y contrarrestan el estrés ambiental biótico y abiótico. ^{[151] [140]} La naturaleza no dirigida de la transcriptómica permite la identificación de nuevas redes transcripcionales en sistemas complejos. Por ejemplo, el análisis comparativo de una variedad de líneas de garbanzo en diferentes etapas de desarrollo identificó perfiles transcripcionales distintos asociados con el estrés por sequía y salinidad , incluida la identificación del papel de las isoformas de transcripción de AP2 - EREBP . ^[151] La investigación de la expresión génica durante la formación de biopelículas por el patógeno fúngico Candida albicans reveló un conjunto corregulado de genes críticos para el establecimiento y mantenimiento de la biopelícula. ^[152]

El perfil transcriptómico también proporciona información crucial sobre los mecanismos de resistencia a los fármacos . El análisis de más de 1000 aislamientos de Plasmodium falciparum , un parásito virulento responsable de la malaria en humanos, ^[153] identificó que la regulación positiva de la respuesta de la proteína desplegada y la progresión más lenta a través de las primeras etapas del ciclo de desarrollo intraeritrocítico asexual estaban asociadas con la resistencia a la artemisinina en aislamientos del sudeste asiático . ^[154]

El uso de la transcriptómica también es importante para investigar las respuestas en el entorno marino. ^[155] En ecología marina, el " estrés " y la " adaptación " han estado entre los temas de investigación más comunes, especialmente relacionados con el estrés antropogénico, como el cambio global y la contaminación . ^[155] La mayoría de los estudios en esta área se han realizado en animales , aunque los invertebrados han estado subrepresentados. ^[155] Un problema aún es una deficiencia en los estudios genéticos funcionales, que obstaculizan las anotaciones de genes , especialmente para especies no modelo, y pueden llevar a conclusiones vagas sobre los efectos de las respuestas estudiadas. ^[155]

Anotación de la función genética

Todas las técnicas transcriptómicas han sido particularmente útiles para identificar las funciones de los genes e identificar a los responsables de fenotipos particulares. La transcriptómica de los ecotipos de Arabidopsis que hiperacumulan metales correlacionó los genes involucrados en la absorción de metales , la tolerancia y la homeostasis con el fenotipo. ^[156] La integración de conjuntos de datos de RNA-Seq en diferentes tejidos se ha utilizado para mejorar la anotación de las funciones de los genes en organismos comercialmente importantes (por ejemplo, pepino ) ^[157] o especies amenazadas (por ejemplo, koala ). ^[158]

El ensamblaje de lecturas de RNA-Seq no depende de un genoma de referencia ^[122] y, por lo tanto, es ideal para estudios de expresión génica de organismos no modelo con recursos genómicos inexistentes o poco desarrollados. Por ejemplo, una base de datos de SNP utilizados en programas de cría de abeto Douglas se creó mediante análisis de transcriptoma de novo en ausencia de un genoma secuenciado . ^[159] De manera similar, los genes que funcionan en el desarrollo de tejido cardíaco, muscular y nervioso en langostas se identificaron comparando los transcriptomas de los diversos tipos de tejido sin el uso de una secuencia genómica. ^[160] RNA-Seq también se puede utilizar para identificar regiones codificantes de proteínas previamente desconocidas en genomas secuenciados existentes.

ARN no codificante

La transcriptómica se aplica más comúnmente al contenido de ARNm de la célula. Sin embargo, las mismas técnicas son igualmente aplicables a los ARN no codificantes (ARNnc) que no se traducen en una proteína, sino que tienen funciones directas (por ejemplo, roles en la traducción de proteínas , replicación de ADN , empalme de ARN y regulación transcripcional ). ^{[161] [162] [163] [164]} Muchos de estos ARNnc afectan estados patológicos, incluidos el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y neurológicas. ^[165]

Bases de datos del transcriptoma

Los estudios transcriptómicos generan grandes cantidades de datos que tienen aplicaciones potenciales que van mucho más allá de los objetivos originales de un experimento. Por ello, los datos sin procesar o procesados ​​pueden depositarse en bases de datos públicas para garantizar su utilidad para la comunidad científica en general. Por ejemplo, en 2018, el Gene Expression Omnibus contenía millones de experimentos. ^[166]

Leyenda: NCBI – Centro Nacional de Información Biotecnológica; EBI – Instituto Europeo de Bioinformática; DDBJ – Banco de Datos de ADN de Japón; ENA – Archivo Europeo de Nucleótidos; MIAME – Información mínima sobre un experimento de microarrays; MINSEQE – Información mínima sobre un experimento de secuenciación de nucleótidos de alto rendimiento.

Véase también

• ómica
  • Genómica
  • Proteómica
  • Metabolómica
  • Venenomica

Referencias

Este artículo fue adaptado de la siguiente fuente bajo una licencia CC BY 4.0 (2017) (informes de los revisores): Rohan Lowe; Neil Shirley; Mark Bleackley; Stephen Dolan; Thomas Shafee (18 de mayo de 2017). "Tecnologías transcriptómicas". PLOS Computational Biology . 13 (5): e1005457. doi : 10.1371/JOURNAL.PCBI.1005457 . ISSN  1553-734X. PMC  5436640 . PMID  28545146. S2CID  3714586. Wikidata  Q33703532.

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Notas

1. En biología molecular,  la hibridación es un fenómeno en el que las moléculas de ácido desoxirribonucleico ( ADN ) o ácido ribonucleico ( ARN )  monocatenario se unen  al  ADN o ARN complementario .
2. Un picolitro es aproximadamente 30 millones de veces más pequeño que una gota de agua.

Lectura adicional

• Lowe R, Shirley N, Bleackley M, Dolan S, Shafee T (mayo de 2017). "Tecnologías transcriptómicas". PLOS Computational Biology . 13 (5): e1005457. Bibcode :2017PLSCB..13E5457L. doi : 10.1371/journal.pcbi.1005457 . PMC  5436640 . PMID  28545146.
• Análisis transcriptómico comparativo en el módulo de referencia en ciencias de la vida
• Software utilizado en transcriptómica:
  • gemelos
  • Calisto
  • sombrero de copa