La precipitación con etanol es un método utilizado para purificar y/o concentrar ARN , ADN y polisacáridos como pectina y xiloglucano a partir de soluciones acuosas mediante la adición de etanol como antidisolvente.
El ADN es polar debido a su columna vertebral de fosfato altamente cargada . Su polaridad lo hace soluble en agua (el agua es polar) según el principio "lo semejante se disuelve lo semejante" .
Debido a la alta polaridad del agua, ilustrada por su alta constante dieléctrica de 80,1 (a 20 °C), las fuerzas electrostáticas entre partículas cargadas son considerablemente menores en solución acuosa que en el vacío o en el aire.
Esta relación se refleja en la ley de Coulomb , que se puede utilizar para calcular la fuerza que actúa sobre dos cargas y separadas por una distancia utilizando la constante dieléctrica (también llamada permitividad estática relativa) del medio en el denominador de la ecuación ( es una ley eléctrica ). constante ):
A nivel atómico, la reducción de la fuerza que actúa sobre una carga se debe a que las moléculas de agua forman una capa de hidratación a su alrededor. Este hecho hace que el agua sea un muy buen disolvente para compuestos cargados como las sales. La fuerza eléctrica que normalmente mantiene unidos los cristales de sal mediante enlaces iónicos se debilita en presencia de agua, lo que permite que los iones se separen del cristal y se propaguen a través de la solución.
El mismo mecanismo opera en el caso de grupos fosfato cargados negativamente en la columna vertebral del ADN: aunque hay iones positivos presentes en la solución, la fuerza electrostática neta relativamente débil les impide formar enlaces iónicos estables con los fosfatos y precipitar fuera de la solución.
El etanol es mucho menos polar que el agua, con una constante dieléctrica de 24,3 (a 25 °C). Esto significa que la adición de etanol a la solución interrumpe el filtrado de las cargas por el agua. Si se agrega suficiente etanol, la atracción eléctrica entre los grupos fosfato y los iones positivos presentes en la solución se vuelve lo suficientemente fuerte como para formar enlaces iónicos estables y precipitación de ADN. Esto suele ocurrir cuando el etanol constituye más del 64% de la solución. Como sugiere el mecanismo, la solución debe contener iones positivos para que se produzca la precipitación; normalmente Na + , NH4 + o Li + desempeñan este papel. [1]
El ADN se precipita asegurándose primero de que esté presente en la solución la concentración correcta de iones positivos (demasiada dará como resultado una gran cantidad de sal que coprecipita con el ADN, muy poca dará como resultado una recuperación incompleta del ADN) y luego agregando dos o tres volúmenes de al menos 95% de etanol. Muchos protocolos recomiendan almacenar el ADN a baja temperatura en este punto, pero también hay observaciones de que es posible que no mejore la recuperación del ADN e incluso puede reducir la eficiencia de la precipitación si se utiliza el tiempo de incubación durante la noche. [2] [3] Por lo tanto, se puede lograr una buena eficiencia a temperatura ambiente, pero cuando se tiene en cuenta la posible degradación, probablemente sea mejor incubar el ADN en hielo húmedo. El tiempo de incubación óptimo depende de la longitud y la concentración del ADN. Los fragmentos más pequeños y las concentraciones más bajas requerirán tiempos más prolongados para lograr una recuperación aceptable. Para longitudes muy pequeñas y concentraciones bajas, se recomienda la incubación durante la noche. En tales casos, el uso de vehículos como ARNt , glucógeno o poliacrilamida lineal puede mejorar enormemente la recuperación.
Durante la incubación, el ADN y algunas sales precipitarán de la solución; en el siguiente paso, este precipitado se recoge mediante centrifugación en un tubo de microcentrífuga a altas velocidades (~12.000 g ). El tiempo y la velocidad de la centrifugación tienen el mayor efecto en las tasas de recuperación del ADN. Nuevamente, los fragmentos más pequeños y las diluciones más altas requieren una centrifugación más larga y rápida. La centrifugación se puede realizar a temperatura ambiente o a 4 °C o 0 °C. Durante la centrifugación, el ADN precipitado tiene que moverse a través de la solución de etanol hasta el fondo del tubo, las temperaturas más bajas aumentan la viscosidad de la solución y los volúmenes más grandes alargan la distancia, por lo que ambos factores reducen la eficiencia de este proceso, lo que requiere una centrifugación más prolongada para lograr el mismo efecto. [2] [3] Después de la centrifugación, la solución sobrenadante se elimina, dejando un sedimento de ADN crudo. Que el sedimento sea visible depende de la cantidad de ADN y de su pureza (los sedimentos más sucios son más fáciles de ver) o del uso de coprecipitantes.
En el siguiente paso, se agrega etanol al 70% al gránulo y se mezcla suavemente para soltar el gránulo y lavarlo. Esto elimina algunas de las sales presentes en el sobrenadante sobrante y se une al sedimento de ADN, lo que hace que el ADN final sea más limpio. Esta suspensión se centrifuga nuevamente para sedimentar nuevamente el ADN y se elimina la solución sobrenadante. Este paso se repite una vez.
Finalmente, el sedimento se seca al aire y el ADN se resuspende en agua u otro tampón deseado . Es importante no secar demasiado el sedimento, ya que puede provocar la desnaturalización del ADN y dificultar su resuspensión.
También se puede utilizar isopropanol en lugar de etanol; la eficacia de precipitación del isopropanol es mayor, lo que hace que un volumen sea suficiente para la precipitación. Sin embargo, el isopropanol es menos volátil que el etanol y necesita más tiempo para secarse al aire en el paso final. El gránulo también podría adherirse menos firmemente al tubo cuando se usa isopropanol. [1]
