La purificación de ácidos nucleicos mediante columnas de centrifugación es un método de extracción en fase sólida para purificar rápidamente los ácidos nucleicos . Este método se basa en el hecho de que el ácido nucleico se unirá a la fase sólida de sílice en determinadas condiciones.
Las diferentes etapas del método son lisar, unir, lavar y eluir. [1] [2] Más específicamente, esto implica la lisis de las células objetivo para liberar los ácidos nucleicos , la unión selectiva del ácido nucleico a una membrana de sílice, el lavado de partículas e inhibidores que no están unidos a la membrana de sílice y la elución del ácido nucleico, siendo el resultado final un ácido nucleico purificado en una solución acuosa.
Para la lisis, las células (sangre, tejido, etc.) de la muestra deben someterse a un tratamiento para romper la membrana celular y liberar el ácido nucleico. Dependiendo del material de destino, esto puede incluir el uso de detergentes u otros tampones, proteinasas u otras enzimas, calentamiento a diferentes tiempos/temperaturas o disrupción mecánica como cortar con un cuchillo o un homogeneizador , usar un mortero o golpear con un molino de bolas.
Para la unión, se añade una solución tampón a la muestra lisada junto con etanol o isopropanol . La muestra en solución de unión se transfiere a una columna de centrifugación, y la columna se coloca en una centrífuga o se conecta a un vacío. La centrífuga/vacío fuerza la solución a pasar a través de una membrana de sílice que se encuentra dentro de la columna de centrifugación, donde, en las condiciones iónicas adecuadas, los ácidos nucleicos se unirán a la membrana de sílice, a medida que el resto de la solución pasa a través de ella. Una vez unido el material de destino, se puede eliminar el flujo.
Para lavar, se añade un nuevo tampón a la columna y luego se centrifuga/aspira a través de la membrana. Este tampón tiene como objetivo mantener las condiciones de unión, al tiempo que elimina las sales de unión y otros contaminantes restantes. Por lo general, se necesitan varios lavados, a menudo con porcentajes crecientes de etanol/isopropanol, hasta que el ácido nucleico en la membrana de sílice esté libre de contaminantes. El último "lavado" suele ser un paso en seco para permitir que el alcohol se evapore, dejando solo los ácidos nucleicos purificados unidos a la columna.
Por último, la elución es el proceso de añadir una solución acuosa a la columna, lo que permite que el ácido nucleico hidrófilo salga de la columna y vuelva a la solución. Este paso se puede mejorar con sal, pH, tiempo o calor. Por último, para capturar el eluato/eluyente, la columna se transfiere a un microtubo limpio antes de un último paso de centrifugación.
Incluso antes de los métodos de ácidos nucleicos que se emplean hoy en día, se sabía que en presencia de agentes caotrópicos , como el yoduro de sodio o el perclorato de sodio , el ADN se une a sílice, partículas de vidrio o algas unicelulares llamadas diatomeas que protegen sus paredes celulares con sílice . Esta propiedad se utilizó para purificar el ácido nucleico utilizando polvo de vidrio o perlas de sílice en condiciones alcalinas. [3] Esto se mejoró más tarde utilizando tiocianato de guanidinio o clorhidrato de guanidinio como agente caotrópico. [4] Para facilitar el manejo, el uso de perlas de vidrio se cambió más tarde a columnas de sílice. Y para permitir el uso de instrumentos de extracción automatizados, se desarrollaron perlas paramagnéticas recubiertas de sílice , más comúnmente conocidas como extracción de "perlas magnéticas".