En la naturaleza se producen varios métodos de empalme de ARN; el tipo de empalme depende de la estructura del intrón empalmado y de los catalizadores necesarios para que se produzca el empalme.
Complejo espliceosómico
Intrones
La palabra intrón se deriva de los términos región intragénica , [1] e intracistrón , [2] es decir, un segmento de ADN que se encuentra entre dos exones de un gen . El término intrón se refiere tanto a la secuencia de ADN dentro de un gen como a la secuencia correspondiente en la transcripción de ARN sin procesar. Como parte de la vía de procesamiento del ARN, los intrones se eliminan mediante el empalme del ARN poco después o simultáneamente con la transcripción . [3] Los intrones se encuentran en los genes de la mayoría de los organismos y muchos virus. Pueden estar ubicados en una amplia gama de genes, incluidos los que generan proteínas , el ARN ribosómico (ARNr) y el ARN de transferencia (ARNt). [4]
Dentro de los intrones, se requieren un sitio donante (extremo 5' del intrón), un sitio de ramificación (cerca del extremo 3' del intrón) y un sitio aceptor (extremo 3' del intrón) para el empalme. El sitio donante de empalme incluye una secuencia GU casi invariante en el extremo 5' del intrón, dentro de una región más grande y menos conservada. El sitio aceptor de empalme en el extremo 3' del intrón termina el intrón con una secuencia AG casi invariante. Corriente arriba (hacia 5') del AG hay una región alta en pirimidinas (C y U), o tracto de polipirimidina . Más arriba del tracto de polipirimidina está el punto de ramificación, que incluye un nucleótido de adenina involucrado en la formación del lazo. [5] [6] La secuencia de consenso para un intrón (en la notación de ácidos nucleicos de la IUPAC ) es: GG-[cut]-GURAGU (sitio donante) ... secuencia del intrón ... YURAC (secuencia de ramificación 20-50 nucleótidos aguas arriba del sitio aceptor) ... Y-rich-NCAG-[cut]-G (sitio aceptor). [7] Sin embargo, se observa que la secuencia específica de elementos de empalme intrónicos y el número de nucleótidos entre el punto de ramificación y el sitio aceptor 3' más cercano afectan la selección del sitio de empalme. [8] [9] Además, las mutaciones puntuales en el ADN subyacente o los errores durante la transcripción pueden activar un sitio de empalme críptico en parte de la transcripción que normalmente no se empalma. Esto da como resultado un ARN mensajero maduro con una sección faltante de un exón. De esta manera, una mutación puntual , que de otro modo podría afectar solo a un solo aminoácido, puede manifestarse como una deleción o truncamiento en la proteína final. [ cita requerida ]
Límite del exón del intrón en el pre-ARNm 1 - Sitio de empalme 3' 2 - Tracto de polipirimidina 3 - Sitio de ramificación 4 - Sitio de empalme 5'
Formación y actividad
El empalme es catalizado por el espliceosoma , un gran complejo de ARN-proteína compuesto por cinco pequeñas ribonucleoproteínas nucleares ( snRNP ). El ensamblaje y la actividad del espliceosoma se producen durante la transcripción del pre-ARNm. Los componentes de ARN de las snRNP interactúan con el intrón y participan en la catálisis. Se han identificado dos tipos de espliceosomas (mayor y menor) que contienen diferentes snRNP .
El espliceosoma principal empalma intrones que contienen GU en el sitio de empalme 5' y AG en el sitio de empalme 3'. Está compuesto por los snRNP U1 , U2 , U4 , U5 y U6 y es activo en el núcleo. Además, varias proteínas, incluido el factor auxiliar 1 del ARN nuclear pequeño U2 (U2AF35), U2AF2 (U2AF65) [10] y SF1 , son necesarias para el ensamblaje del espliceosoma. [6] [11] El espliceosoma forma diferentes complejos durante el proceso de empalme: [12]
Complejo E
El snRNP U1 se une a la secuencia GU en el sitio de empalme 5' de un intrón;
El snRNP U2 desplaza a SF1 y se une a la secuencia del punto de ramificación y el ATP se hidroliza;
Complejo B (spliceosoma precatalítico)
El trímero snRNP U5/U4/U6 se une, y el snRNP U5 se une a los exones en el sitio 5', y el U6 se une a U2;
Complejo B*
Se libera el snRNP U1, el U5 cambia de exón a intrón y el U6 se une al sitio de empalme 5';
Complejo C (spliceosoma catalítico)
Se libera U4, U6/U2 cataliza la transesterificación, haciendo que el extremo 5' del intrón se ligue a la A en el intrón y forme un lazo, U5 se une al exón en el sitio de empalme 3' y el sitio 5' se escinde, lo que da como resultado la formación del lazo;
Complejo C* (complejo post-spliceosómico)
U2/U5/U6 permanecen unidos al lazo, y el sitio 3' se escinde y los exones se ligan mediante hidrólisis de ATP. El ARN empalmado se libera, el lazo se libera y se degrada [14] y los snRNP se reciclan.
Este tipo de empalme se denomina empalme canónico o vía del lazo , y representa más del 99 % del empalme. Por el contrario, cuando las secuencias flanqueantes intrónicas no siguen la regla GU-AG, se dice que se produce un empalme no canónico (véase "spliceosoma menor" a continuación). [15]
El espliceosoma menor es muy similar al espliceosoma mayor, pero en su lugar, escinde intrones raros con diferentes secuencias de sitios de espliceo. Mientras que los espliceosomas menor y mayor contienen el mismo snRNP U5 , el espliceosoma menor tiene snRNP diferentes pero funcionalmente análogos para U1, U2, U4 y U6, que se denominan respectivamente U11 , U12 , U4atac y U6atac . [16]
Empalme recursivo
En la mayoría de los casos, el splicing elimina los intrones como unidades individuales de las transcripciones de ARNm precursores . Sin embargo, en algunos casos, especialmente en ARNm con intrones muy largos, el splicing se produce en pasos, con parte de un intrón eliminado y luego el intrón restante se empalma en un paso siguiente. Esto se ha encontrado primero en el gen Ultrabithorax ( Ubx ) de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster , y algunos otros genes de Drosophila , pero también se han informado casos en humanos. [17] [18]
Trans-empalme
El trans-splicing es una forma de splicing que elimina intrones u outrones y une dos exones que no están dentro de la misma transcripción de ARN. [19] El trans-splicing puede ocurrir entre dos pre-ARNm endógenos diferentes o entre un ARN endógeno y uno exógeno (como los de los virus) o artificiales. [20]
Autoempalme
El autoempalme se produce en intrones raros que forman una ribozima , que realiza las funciones del espliceosoma solo por el ARN. Hay tres tipos de intrones que se autoempalman: grupo I , grupo II y grupo III . Los intrones de los grupos I y II realizan un empalme similar al del espliceosoma sin necesidad de ninguna proteína. Esta similitud sugiere que los intrones de los grupos I y II pueden estar relacionados evolutivamente con el espliceosoma. El autoempalme también puede ser muy antiguo y puede haber existido en un mundo de ARN presente antes de la proteína. [ cita requerida ]
El 3'OH de un nucleósido de guanina libre (o uno ubicado en el intrón) o un cofactor de nucleótido (GMP, GDP, GTP) ataca al fosfato en el sitio de empalme 5'.
El 3'OH del exón 5' se convierte en un nucleófilo y la segunda transesterificación da como resultado la unión de los dos exones.
El mecanismo mediante el cual se unen los intrones del grupo II (dos reacciones de transesterificación como los intrones del grupo I) es el siguiente:
El 2'OH de una adenosina específica en el intrón ataca el sitio de empalme 5', formando así el lazo.
El 3'OH del exón 5' desencadena la segunda transesterificación en el sitio de empalme 3', uniendo así los exones.
Empalme de ARNt
El empalme del ARNt (también llamado ARNt similar) es otra forma poco común de empalme que suele ocurrir en el ARNt. La reacción de empalme implica una bioquímica diferente a la de las vías de empalme espliceosómico y autoempalme.
En la levadura Saccharomyces cerevisiae , un heterotetrámero de endonucleasa de empalme de ARNt de levadura , compuesto por TSEN54 , TSEN2 , TSEN34 y TSEN15 , escinde el pre-ARNt en dos sitios en el bucle aceptor para formar un ARNt de mitad 5', que termina en un grupo fosfodiéster cíclico 2',3', y un ARNt de mitad 3', que termina en un grupo hidroxilo 5', junto con un intrón descartado. [21] La ARNt quinasa de levadura luego fosforila el grupo hidroxilo 5' usando trifosfato de adenosina . La ARNt fosfodiesterasa cíclica de levadura escinde el grupo fosfodiéster cíclico para formar un extremo 3' fosforilado en 2'. La ligasa de ARNt de levadura agrega un grupo monofosfato de adenosina al extremo 5' de la mitad 3' y une las dos mitades. [22] Luego, la 2'-fosfotransferasa dependiente de NAD elimina el grupo 2'-fosfato. [23] [24]
Evolución
El empalme ocurre en todos los reinos o dominios de la vida, sin embargo, la extensión y los tipos de empalme pueden ser muy diferentes entre las principales divisiones. Los eucariotas empalman muchos ARN mensajeros codificadores de proteínas y algunos ARN no codificantes . Los procariotas , por otro lado, empalman raramente y en su mayoría ARN no codificantes. Otra diferencia importante entre estos dos grupos de organismos es que los procariotas carecen por completo de la vía espliceosómica.
Debido a que los intrones espliceosomales no se conservan en todas las especies, existe un debate sobre cuándo evolucionó el empalme espliceosomal. Se han propuesto dos modelos: el modelo intrón tardío y el modelo intrón temprano (ver evolución intrón ).
Mecanismo bioquímico
Diagrama que ilustra la bioquímica de dos pasos del empalme.
El empalme espliceosómico y el autoempalme implican un proceso bioquímico de dos pasos. Ambos pasos implican reacciones de transesterificación que ocurren entre nucleótidos de ARN. Sin embargo, el empalme de ARNt es una excepción y no ocurre por transesterificación. [25]
Las reacciones de transesterificación espliceosómicas y de auto-empalme ocurren a través de dos reacciones de transesterificación secuenciales. Primero, el 2'OH de un nucleótido de punto de ramificación específico dentro del intrón, definido durante el ensamblaje del espliceosoma, realiza un ataque nucleofílico en el primer nucleótido del intrón en el sitio de empalme 5', formando el intermedio de lazo . Segundo, el 3'OH del exón 5' liberado realiza un ataque nucleofílico en el primer nucleótido después del último nucleótido del intrón en el sitio de empalme 3', uniendo así los exones y liberando el lazo del intrón. [26]
Empalme alternativo
En muchos casos, el proceso de empalme puede crear una gama de proteínas únicas al variar la composición de exones del mismo ARNm. Este fenómeno se denomina empalme alternativo . El empalme alternativo puede ocurrir de muchas maneras. Los exones se pueden extender u omitir, o se pueden retener los intrones. Se estima que el 95% de las transcripciones de genes multiexónicos experimentan empalme alternativo, algunos de los cuales ocurren de manera específica de tejido y/o bajo condiciones celulares específicas. [27] El desarrollo de tecnología de secuenciación de ARNm de alto rendimiento puede ayudar a cuantificar los niveles de expresión de isoformas empalmadas alternativamente. Los niveles de expresión diferencial en tejidos y linajes celulares permitieron desarrollar enfoques computacionales para predecir las funciones de estas isoformas. [28] [29]
Dada esta complejidad, el empalme alternativo de las transcripciones de pre-ARNm está regulado por un sistema de proteínas trans-actuantes (activadores y represores) que se unen a sitios cis-actuantes o "elementos" (potenciadores y silenciadores) en la propia transcripción de pre-ARNm. Estas proteínas y sus respectivos elementos de unión promueven o reducen el uso de un sitio de empalme particular. La especificidad de unión proviene de la secuencia y estructura de los elementos cis, por ejemplo, en el VIH-1 hay muchos sitios de empalme donantes y aceptores. Entre los diversos sitios de empalme, ssA7, que es el sitio aceptor 3', se pliega en tres estructuras de bucle de tallo, es decir, silenciador de empalme intrónico (ISS), potenciador de empalme exónico (ESE) y silenciador de empalme exónico (ESSE3). La estructura de la solución del silenciador de empalme intrónico y su interacción con la proteína huésped hnRNPA1 brindan información sobre el reconocimiento específico. [30] Sin embargo, lo que aumenta la complejidad del splicing alternativo es que los efectos de los factores reguladores dependen muchas veces de la posición. Por ejemplo, un factor de splicing que actúa como activador del splicing cuando se une a un elemento potenciador intrónico puede actuar como represor cuando se une a su elemento de splicing en el contexto de un exón, y viceversa. [31] Además de los efectos dependientes de la posición de los elementos potenciadores y silenciadores, la ubicación del punto de ramificación (es decir, la distancia aguas arriba del sitio aceptor 3' más cercano) también afecta al splicing. [8] La estructura secundaria de la transcripción del pre-ARNm también desempeña un papel en la regulación del splicing, por ejemplo, reuniendo elementos de splicing o enmascarando una secuencia que, de otro modo, serviría como elemento de unión para un factor de splicing. [32] [33]
Papel de las motas nucleares en el empalme del ARN
La ubicación del empalme del pre-ARNm se encuentra en todo el núcleo y, una vez que se genera el ARNm maduro, se transporta al citoplasma para su traducción. En las células animales y vegetales, las motas nucleares son regiones con altas concentraciones de factores de empalme. Se pensaba que estas motas eran meros centros de almacenamiento de factores de empalme. Sin embargo, ahora se entiende que las motas nucleares ayudan a concentrar los factores de empalme cerca de los genes que se encuentran físicamente cerca de ellas. Los genes ubicados más lejos de las motas aún pueden transcribirse y empalmarse, pero su empalme es menos eficiente en comparación con los más cercanos a las motas. Las células pueden variar sus posiciones genómicas de los genes en relación con las motas nucleares como un mecanismo para modular la expresión de los genes a través del empalme. [34]
Papel del splicing/splicing alternativo en la integración del VIH
El proceso de empalme está vinculado con la integración del VIH , ya que el VIH-1 se dirige a genes altamente empalmados. [35]
Respuesta de empalme al daño del ADN
El daño del ADN afecta a los factores de empalme al alterar su modificación postraduccional , localización, expresión y actividad. [36] Además, el daño del ADN a menudo altera el empalme al interferir con su acoplamiento a la transcripción . El daño del ADN también tiene un impacto en el empalme y empalme alternativo de genes íntimamente asociados con la reparación del ADN . [36] Por ejemplo, los daños del ADN modulan el empalme alternativo de los genes de reparación del ADN Brca1 y Ercc1 .
Manipulación experimental del splicing
Los eventos de empalme se pueden alterar experimentalmente [37] [38] mediante la unión de oligos antisentido bloqueantes estéricos , como morfolinos o ácidos nucleicos peptídicos a sitios de unión de snRNP, al nucleótido del punto de ramificación que cierra el lazo, [39] o a sitios de unión de elementos reguladores de empalme. [40]
El uso de oligonucleótidos antisentido para modular el empalme ha demostrado ser muy prometedor como estrategia terapéutica para una variedad de enfermedades genéticas causadas por defectos de empalme. [41]
Estudios recientes han demostrado que el empalme del ARN puede regularse mediante una variedad de modificaciones epigenéticas, incluidas la metilación del ADN y las modificaciones de las histonas. [42]
Errores de empalme y variación
Se ha sugerido que un tercio de todas las mutaciones que causan enfermedades afectan el empalme . [31] Los errores comunes incluyen:
Mutación de un sitio de empalme que provoca la pérdida de la función de ese sitio. Produce la exposición de un codón de terminación prematuro , la pérdida de un exón o la inclusión de un intrón.
Mutación de un sitio de empalme que reduce la especificidad. Puede dar lugar a una variación en la ubicación del empalme, lo que provoca la inserción o eliminación de aminoácidos o, más probablemente, una alteración del marco de lectura .
Desplazamiento de un sitio de empalme, que conduce a la inclusión o exclusión de más ARN de lo esperado, lo que da como resultado exones más largos o más cortos.
Aunque muchos errores de empalme están protegidos por un mecanismo de control de calidad celular denominado desintegración del ARNm mediada por sinsentidos (NMD), [43] también existen varias enfermedades relacionadas con el empalme, como se sugirió anteriormente. [44]
Es probable que las diferencias alélicas en el empalme del ARNm sean una fuente común e importante de diversidad fenotípica a nivel molecular, además de su contribución a la susceptibilidad a enfermedades genéticas. De hecho, estudios de todo el genoma en humanos han identificado una variedad de genes que están sujetos al empalme específico de alelos.
En las plantas, la variación de la tolerancia al estrés por inundaciones se correlacionó con el empalme alternativo inducido por estrés de las transcripciones asociadas con la gluconeogénesis y otros procesos. [45]
Empalme de proteínas
Además del ARN, las proteínas pueden sufrir empalmes. Aunque los mecanismos biomoleculares son diferentes, el principio es el mismo: se eliminan partes de la proteína, llamadas inteínas en lugar de intrones, y las partes restantes, llamadas exteínas en lugar de exones, se fusionan. El empalme de proteínas se ha observado en una amplia gama de organismos, incluidas bacterias, arqueas , plantas, levaduras y humanos. [46]
Empalme y génesis de los circRNA
La existencia del retrosplicing se sugirió por primera vez en 2012. [47] Este retrosplicing explica la génesis de los ARN circulares resultantes de la unión exacta entre el límite 3' de un exón con el límite 5' de un exón ubicado aguas arriba. [48] En estos ARN circulares exónicos, la unión es un enlace 3'-5' clásico.
La exclusión de secuencias intrónicas durante el empalme también puede dejar rastros, en forma de ARN circulares. [49] En algunos casos, el lazo intrónico no se destruye y la parte circular permanece como un ARN circular derivado del lazo [50] . En estos ARN circulares derivados del lazo, la unión es un enlace 2'-5'.
Véase también
Wikimedia Commons tiene medios relacionados con Empalme .
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Enlaces externos
Colección de animaciones de células virtuales: empalme de ARNm
