Las ribozimas ( enzimas de los ácidos ribonucleicos ) son moléculas de ARN que tienen la capacidad de catalizar reacciones bioquímicas específicas, incluyendo el empalme de ARN en la expresión génica , de forma similar a la acción de las enzimas proteicas . El descubrimiento de las ribozimas en 1982 demostró que el ARN puede ser tanto material genético (como el ADN ) como un catalizador biológico (como las enzimas proteicas), y contribuyó a la hipótesis del mundo del ARN , que sugiere que el ARN puede haber sido importante en la evolución de los sistemas prebióticos autorreplicantes . [1]
Las actividades más comunes de las ribozimas naturales o evolucionadas in vitro son la escisión (o ligadura) de ARN y ADN y la formación de enlaces peptídicos. [2] Por ejemplo, la ribozima más pequeña conocida (GUGGC-3') puede aminoacilar una secuencia GCCU-3' en presencia de PheAMP. [3] Dentro del ribosoma , las ribozimas funcionan como parte de la subunidad grande del ARN ribosómico para unir aminoácidos durante la síntesis de proteínas . También participan en una variedad de reacciones de procesamiento de ARN , incluido el empalme de ARN , la replicación viral y la biosíntesis de ARN de transferencia . Los ejemplos de ribozimas incluyen la ribozima cabeza de martillo , la ribozima VS , la leadzima y la ribozima horquilla .
Los investigadores que están investigando los orígenes de la vida a través de la hipótesis del mundo del ARN han estado trabajando en el descubrimiento de una ribozima con la capacidad de autorreplicarse, lo que requeriría que tuviera la capacidad de sintetizar catalíticamente polímeros de ARN. Esto debería poder suceder en condiciones prebióticamente plausibles con altas tasas de precisión de copia para evitar la degradación de la información, pero también permitiendo la ocurrencia de errores ocasionales durante el proceso de copia para permitir que la evolución darwiniana continúe. [4]
Se han realizado intentos para desarrollar ribozimas como agentes terapéuticos, como enzimas que se dirigen a secuencias de ARN definidas para su escisión, como biosensores y para aplicaciones en genómica funcional y descubrimiento de genes. [5]
Antes del descubrimiento de las ribozimas, las enzimas —que se definían [solamente] como proteínas catalíticas— eran los únicos catalizadores biológicos conocidos . En 1967, Carl Woese , Francis Crick y Leslie Orgel fueron los primeros en sugerir que el ARN podía actuar como catalizador. Esta idea se basaba en el descubrimiento de que el ARN puede formar estructuras secundarias complejas . [6] Estas ribozimas se encontraron en el intrón de una transcripción de ARN, que se eliminó de la transcripción, así como en el componente de ARN del complejo RNasa P, que está involucrado en la maduración de los pre- ARNt . En 1989, Thomas R. Cech y Sidney Altman compartieron el Premio Nobel de Química por su "descubrimiento de las propiedades catalíticas del ARN". [7] El término ribozima fue introducido por primera vez por Kelly Kruger et al. en un artículo publicado en Cell en 1982. [1]
En biología, se creía firmemente que la catálisis estaba reservada a las proteínas. Sin embargo, la idea de la catálisis del ARN está motivada en parte por la vieja pregunta sobre el origen de la vida: ¿qué viene primero, las enzimas que realizan el trabajo de la célula o los ácidos nucleicos que llevan la información necesaria para producir las enzimas? El concepto de "ácidos ribonucleicos como catalizadores" evita este problema. El ARN, en esencia, puede ser tanto el huevo como la gallina. [8]
En la década de 1980, Thomas Cech, de la Universidad de Colorado en Boulder , estaba estudiando la escisión de intrones en un gen de ARN ribosómico en Tetrahymena thermophila . Mientras intentaba purificar la enzima responsable de la reacción de empalme, descubrió que el intrón podía ser extirpado sin ningún extracto celular añadido. Por mucho que lo intentaron, Cech y sus colegas no pudieron identificar ninguna proteína asociada con la reacción de empalme. Después de mucho trabajo, Cech propuso que la porción de secuencia del intrón del ARN podía romper y reformar enlaces fosfodiéster . Casi al mismo tiempo, Sidney Altman, profesor de la Universidad de Yale , estaba estudiando la forma en que se procesan las moléculas de ARNt en la célula cuando él y sus colegas aislaron una enzima llamada ARNasa-P , que es responsable de la conversión de un ARNt precursor en el ARNt activo. Para su sorpresa, descubrieron que la ARNasa-P contenía ARN además de proteína y que el ARN era un componente esencial de la enzima activa. Esta idea era tan extraña que tuvieron dificultades para publicar sus hallazgos. El año siguiente [¿ cuál? ] , Altman demostró que el ARN puede actuar como catalizador al demostrar que la subunidad de ARN RNasa-P podía catalizar la escisión del ARNt precursor en ARNt activo en ausencia de cualquier componente proteico.
Desde el descubrimiento de Cech y Altman, otros investigadores han descubierto otros ejemplos de moléculas de ARN que se autoescinden o de ARN catalítico. Muchas ribozimas tienen un centro activo en forma de horquilla (o de cabeza de martillo) y una estructura secundaria única que les permite escindir otras moléculas de ARN en secuencias específicas. Ahora es posible fabricar ribozimas que escindan específicamente cualquier molécula de ARN. Estos catalizadores de ARN pueden tener aplicaciones farmacéuticas. Por ejemplo, se ha diseñado una ribozima para escindir el ARN del VIH . Si una célula fabricara una ribozima de este tipo, todas las partículas de virus entrantes tendrían su genoma de ARN escindido por la ribozima, lo que evitaría la infección.
A pesar de tener solo cuatro opciones para cada unidad monomérica (nucleótidos), en comparación con las 20 cadenas laterales de aminoácidos que se encuentran en las proteínas, las ribozimas tienen estructuras y mecanismos diversos. En muchos casos, son capaces de imitar el mecanismo utilizado por sus contrapartes proteicas. Por ejemplo, en las ribozimas ARN autoescindibles, se lleva a cabo una reacción SN2 en línea utilizando el grupo hidroxilo 2' como nucleófilo que ataca el fosfato puente y hace que el oxígeno 5' de la base N+1 actúe como un grupo saliente. En comparación, la ARNasa A, una proteína que cataliza la misma reacción, utiliza una histidina y una lisina coordinadoras para actuar como base para atacar la cadena principal de fosfato. [2] [ aclaración necesaria ]
Al igual que muchas enzimas proteicas, la unión de metales también es fundamental para la función de muchas ribozimas. [9] A menudo, estas interacciones utilizan tanto la cadena principal de fosfato como la base del nucleótido, lo que provoca cambios conformacionales drásticos. [10] Hay dos clases de mecanismos para la escisión de una cadena principal de fosfodiéster en presencia de metal. En el primer mecanismo, el grupo 2'-OH interno ataca el centro de fósforo en un mecanismo SN 2. Los iones metálicos promueven esta reacción primero coordinando el oxígeno del fosfato y luego estabilizando el oxianión. El segundo mecanismo también sigue un desplazamiento SN 2 , pero el nucleófilo proviene del agua o de grupos hidroxilo exógenos en lugar del propio ARN. La ribozima más pequeña es UUU, que puede promover la escisión entre G y A del tetranucleótido GAAA a través del primer mecanismo en presencia de Mn 2+ . La razón por la que este trinucleótido (en lugar del tetrámero complementario) cataliza esta reacción puede ser porque el emparejamiento UUU-AAA es el trinucleótido más débil y flexible entre las 64 conformaciones, que proporciona el sitio de unión para Mn 2+ . [11]
La transferencia de fosforilo también puede catalizarse sin iones metálicos. Por ejemplo, la ribonucleasa A pancreática y las ribozimas del virus de la hepatitis delta (HDV) pueden catalizar la escisión de la cadena principal del ARN mediante catálisis ácido-base sin iones metálicos. [12] [13] La ribozima en horquilla también puede catalizar la autoescisión del ARN sin iones metálicos, pero el mecanismo para esto aún no está claro. [13]
La ribozima también puede catalizar la formación de enlaces peptídicos entre aminoácidos adyacentes al reducir la entropía de activación. [12]
Aunque las ribozimas son bastante raras en la mayoría de las células, sus funciones son a veces esenciales para la vida. Por ejemplo, la parte funcional del ribosoma , la máquina biológica que traduce el ARN en proteínas, es fundamentalmente una ribozima, compuesta de motivos estructurales terciarios del ARN que a menudo se coordinan con iones metálicos como Mg 2+ como cofactores . [14] En un sistema modelo, no hay ningún requisito de cationes divalentes en un ARN de cinco nucleótidos que cataliza la transfenilalanación de un sustrato de cuatro nucleótidos con 3 pares de bases complementarios con el catalizador, donde el catalizador/sustrato se idearon mediante el truncamiento de la ribozima C3. [15]
Las ribozimas mejor estudiadas son probablemente aquellas que se cortan a sí mismas o a otros ARN, como en el descubrimiento original de Cech [16] y Altman. [17] Sin embargo, las ribozimas pueden diseñarse para catalizar una variedad de reacciones, muchas de las cuales pueden ocurrir en la vida pero no han sido descubiertas en las células. [18]
El ARN puede catalizar el plegamiento de la conformación proteica patológica de un prión de una manera similar a la de una chaperonina . [19]
El ARN también puede actuar como una molécula hereditaria, lo que animó a Walter Gilbert a proponer que en el pasado lejano, la célula usaba el ARN tanto como material genético como molécula estructural y catalítica en lugar de dividir estas funciones entre el ADN y la proteína como lo hacen hoy; esta hipótesis se conoce como la " hipótesis del mundo del ARN " del origen de la vida . [20] Dado que los nucleótidos y el ARN (y por lo tanto las ribozimas) pueden surgir de sustancias químicas inorgánicas, son candidatos para las primeras enzimas y, de hecho, los primeros "replicadores" (es decir, macromoléculas que contienen información y que se replican a sí mismas). Un ejemplo de una ribozima autorreplicante que liga dos sustratos para generar una copia exacta de sí misma fue descrito en 2002. [21] El descubrimiento de la actividad catalítica del ARN resolvió la paradoja del "huevo y la gallina" del origen de la vida, resolviendo el problema del origen de los péptidos y los ácidos nucleicos, un dogma central. Según este escenario, en el origen de la vida, toda la actividad enzimática y la codificación de la información genética la realizaba una sola molécula: el ARN.
En el laboratorio se han producido ribozimas capaces de catalizar la síntesis de otras moléculas de ARN a partir de monómeros activados en condiciones muy específicas; estas moléculas se conocen como ribozimas de la ARN polimerasa . [22] La primera ribozima de la ARN polimerasa se informó en 1996 y era capaz de sintetizar polímeros de ARN de hasta 6 nucleótidos de longitud. [23] Se ha realizado mutagénesis y selección en una ribozima de la ARN ligasa a partir de un gran grupo de secuencias de ARN aleatorias, [24] lo que dio como resultado el aislamiento de la ribozima de la ARN polimerasa "Round-18" mejorada en 2001, que podría catalizar polímeros de ARN de hasta 14 nucleótidos de longitud. [25] Tras la aplicación de una selección adicional en la ribozima Round-18, se generó la ribozima B6.61 y fue capaz de agregar hasta 20 nucleótidos a una plantilla de cebador en 24 horas, hasta que se descompone por escisión de sus enlaces fosfodiéster. [26]
La velocidad a la que las ribozimas pueden polimerizar una secuencia de ARN se multiplica sustancialmente cuando tiene lugar dentro de una micela . [27]
La siguiente ribozima descubierta fue la ribozima "tC19Z", que puede agregar hasta 95 nucleótidos con una fidelidad de 0,0083 mutaciones/nucleótido. [28] Luego, los investigadores descubrieron la ribozima "tC9Y", que además fue capaz de sintetizar cadenas de ARN de hasta 206 nucleótidos de longitud en condiciones de fase eutéctica a temperatura bajo cero, [29] condiciones que previamente se había demostrado que promueven la actividad de la ribozima polimerasa. [30]
La ribozima de la ARN polimerasa (RPR), denominada tC9-4M, fue capaz de polimerizar cadenas de ARN más largas que ella (es decir, más largas que 177 nt) en concentraciones de iones de magnesio cercanas a los niveles fisiológicos, mientras que las RPR anteriores requerían concentraciones prebióticamente improbables de hasta 200 mM. El único factor necesario para lograrlo fue la presencia de un polímero de aminoácidos muy simple llamado decapéptido de lisina. [31]
La RPR más compleja sintetizada hasta ese momento se denominó 24-3, que era capaz de polimerizar las secuencias de una variedad sustancial de secuencias de nucleótidos y navegar a través de estructuras secundarias complejas de sustratos de ARN inaccesibles para las ribozimas anteriores. De hecho, este experimento fue el primero en utilizar una ribozima para sintetizar una molécula de ARNt. [32] A partir de la ribozima 24-3, Tjhung et al. [33] aplicaron otras catorce rondas de selección para obtener una ribozima de la ARN polimerasa mediante evolución in vitro denominada '38-6' que tiene un nivel de actividad sin precedentes en la copia de moléculas de ARN complejas. Sin embargo, esta ribozima no puede copiarse a sí misma y sus productos de ARN tienen una alta tasa de mutación . En un estudio posterior, los investigadores comenzaron con la ribozima 38-6 y aplicaron otras 14 rondas de selección para generar la ribozima '52-2', que en comparación con la 38-6, fue nuevamente mucho más activa y pudo comenzar a generar niveles detectables y funcionales de la ligasa de clase I, aunque todavía estaba limitada en su fidelidad y funcionalidad en comparación con la copia de la misma plantilla por proteínas como la ARN polimerasa T7. [34]
Un RPR llamado t5(+1) agrega nucleótidos tripletes a la vez en lugar de solo un nucleótido a la vez. Este RPR heterodimérico puede navegar por estructuras secundarias inaccesibles para 24-3, incluidas las horquillas. En el grupo inicial de variantes de ARN derivadas solo de un RPR previamente sintetizado conocido como RPR Z, surgieron dos secuencias por separado y evolucionaron para ser mutualistamente dependientes entre sí. El ARN tipo 1 evolucionó para ser catalíticamente inactivo, pero la formación de complejos con el ARN tipo 5 impulsó su capacidad de polimerización y permitió interacciones intermoleculares con el sustrato de la plantilla de ARN, obviando la necesidad de unir la plantilla directamente a la secuencia de ARN del RPR, lo que era una limitación de estudios anteriores. No solo t5(+1) no necesitaba unirse a la plantilla, sino que tampoco necesitaba un cebador ya que t5(+1) tenía la capacidad de polimerizar una plantilla tanto en direcciones 3' → 5' como 5' 3 → 3'. [35]
Una ribozima de la ARN polimerasa altamente evolucionada [ vaga ] fue capaz de funcionar como una transcriptasa inversa , es decir, puede sintetizar una copia de ADN utilizando una plantilla de ARN. [36] Se considera [¿ por quién? ] que dicha actividad fue crucial para la transición de los genomas de ARN a los de ADN durante la historia temprana de la vida en la Tierra. La capacidad de transcripción inversa podría haber surgido como una función secundaria de una ribozima de la ARN polimerasa dependiente de ARN temprana.
Una secuencia de ARN que se pliega en una ribozima es capaz de invadir el ARN dúplex, reorganizarse en un complejo de holopolimerasa abierto y luego buscar una secuencia promotora de ARN específica y, al reconocerla, reorganizarse nuevamente en una forma procesiva que polimeriza una cadena complementaria de la secuencia. Esta ribozima es capaz de extender el ARN dúplex hasta 107 nucleótidos y lo hace sin necesidad de unir la secuencia que se está polimerizando. [37]
Desde el descubrimiento de las ribozimas que existen en los organismos vivos, ha habido interés en el estudio de nuevas ribozimas sintéticas creadas en el laboratorio. Por ejemplo, se han producido ARN autoescindibles producidos artificialmente con buena actividad enzimática. Tang y Breaker [38] aislaron ARN autoescindibles mediante la selección in vitro de ARN originados a partir de ARN de secuencia aleatoria. Algunas de las ribozimas sintéticas que se produjeron tenían estructuras novedosas, mientras que otras eran similares a la ribozima cabeza de martillo que se produce de forma natural.
En 2015, investigadores de la Universidad Northwestern y la Universidad de Illinois en Chicago diseñaron un ribosoma anclado que funciona casi tan bien como el componente celular auténtico que produce todas las proteínas y enzimas dentro de la célula. Llamado Ribosoma-T, o Ribo-T, el ribosoma artificial fue creado por Michael Jewett y Alexander Mankin. [39] Las técnicas utilizadas para crear ribozimas artificiales implican una evolución dirigida. Este enfoque aprovecha la naturaleza dual del ARN como catalizador y polímero informativo, lo que facilita que un investigador produzca vastas poblaciones de catalizadores de ARN utilizando enzimas polimerasas . Las ribozimas se mutan mediante transcripción inversa con transcriptasa inversa en varios ADNc y se amplifican con PCR propensa a errores . Los parámetros de selección en estos experimentos a menudo difieren. Un enfoque para seleccionar una ribozima de ligasa implica el uso de etiquetas de biotina , que están unidas covalentemente al sustrato. Si una molécula posee la actividad de ligasa deseada, se puede utilizar una matriz de estreptavidina para recuperar las moléculas activas.
Lincoln y Joyce utilizaron la evolución in vitro para desarrollar ligasas de ribozima capaces de autorreplicarse en aproximadamente una hora, mediante la unión de oligonucleótidos altamente complementarios presintetizados. [40]
Aunque no son verdaderos catalizadores, la creación de riboswitches artificiales autoescindibles , denominados aptazimas , también ha sido un área activa de investigación. Los riboswitches son motivos reguladores de ARN que cambian su estructura en respuesta a un ligando de molécula pequeña para regular la traducción. Si bien existen muchos riboswitches naturales conocidos que se unen a una amplia gama de metabolitos y otras moléculas orgánicas pequeñas, solo se ha descrito una ribozima basada en un riboswitch: glmS . [41] Los primeros trabajos en la caracterización de riboswitches autoescindibles se centraron en el uso de teofilina como ligando. En estos estudios, se forma una horquilla de ARN que bloquea el sitio de unión del ribosoma , inhibiendo así la traducción. En presencia del ligando , en estos casos teofilina, la región reguladora del ARN se escinde, lo que permite que el ribosoma se una y traduzca el gen objetivo. Gran parte de este trabajo de ingeniería del ARN se basó en el diseño racional y en estructuras de ARN determinadas previamente, en lugar de en una evolución dirigida como en los ejemplos anteriores. Trabajos más recientes han ampliado los ligandos utilizados en los riboswitches de ribozimas para incluir el pirofosfato de timina. La clasificación celular activada por fluorescencia también se ha utilizado para diseñar aptazimas. [42]
Se han propuesto y desarrollado ribozimas para el tratamiento de enfermedades mediante terapia génica . Uno de los principales desafíos del uso de enzimas basadas en ARN como terapia es la corta vida media de las moléculas catalíticas de ARN en el cuerpo. Para combatir esto, se modifica la posición 2' de la ribosa para mejorar la estabilidad del ARN. Un área de la terapia génica con ribozimas ha sido la inhibición de los virus basados en ARN.
Se ha desarrollado un tipo de ribozima sintética dirigida contra el ARN del VIH , llamada gen shears , y ha entrado en pruebas clínicas para la infección por VIH. [43] [44]
De manera similar, se han diseñado ribozimas para atacar el ARN del virus de la hepatitis C , el coronavirus del SARS (SARS-CoV), [45] el adenovirus [45] y el ARN del virus de la influenza A y B. [46] [47] [48] [45] La ribozima es capaz de escindir las regiones conservadas del genoma del virus, lo que se ha demostrado que reduce el virus en cultivos de células de mamíferos. [49] A pesar de estos esfuerzos de los investigadores, estos proyectos han permanecido en la etapa preclínica.
Clases de ribozimas naturales bien validadas:
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